ICS65.020.20 CCSB16 中华人民共和国国家标准 GB/T33117—2026 代替GB/T33117—2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofOculimaculayallundae(Wallwork&Spooner) Crous&W.Gams 2026-03-31发布 2026-10-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T33117—2016《小麦基腐病菌检疫鉴定方法》,与GB/T33117—2016相比,除结 构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———更改了“范围”(见第1章,2016年版的第1章); ———更改了“小麦基腐病菌基本信息”(见第4章,2016年版的第3章); ———更改了“原理”(见第5章,2016年版的第4章); ———更改了“试剂或材料”(见第6章,2016年版的5.2和附录C); ———更改了“仪器设备”(见第7章,2016年版的5.1); ———更改了“取样”(见第8章,2016年版的第6章); ———更改了“试验步骤”(见第9章,2016年版的第7章); ———更改了“鉴定特征”(见第10章,2016年版的第8章); ———更改了“结果判定”(见第11章,2016年版的第9章); ———更改了“样品保存与处理”(见第12章,2016年版的第10章); ———更改了“菌株保存与处理”(见第13章,2016年版的第11章); ———更改了“结果记录与资料保存”(见第14章,2016年版的第12章); ———更改了“PCR检测方法”(见附录B,2016年版的附录B)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本文件起草单位:青岛海关技术中心、临沂科技职业学院、南京海关动植物与食品检测中心、临沂 大学、沈阳海关技术中心、东港海关综合技术服务中心。 本文件主要起草人:吴兴海、王英超、许剑涛、付海滨、季蕾、刘云国、王荣、李辉、封立平、李建勇、 吴翠萍、李井干、杨斌。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2016年首次发布为GB/T33117—2016; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T33117—2026小麦基腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件描述了小麦基腐病菌[Oculimaculayallundae(Wallwork&Spooner)Crous&W.Gams] 的检疫鉴定方法。 本文件适用于小麦基腐病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1538.1 培养基制备指南 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 小麦基腐病菌基本信息 学名:Oculimaculayallundae(Wallwork&Spooner)Crous&W.Gams2003 异名:Pseudocercosporellaherpotrichoides(Fron)Deighton1973.Cercosporellaherpotrichoides Fron1912,Helgardiaherpotrichoides(Fron)Crous&W.Gams2003,Ramulisporaherpotrichoides (Fron)Arx1983;Tapesiayallundaevar.yallundae(Fron)Wallwork&.Spooner1988 分类地位:真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌纲(Pezizomycetes),盘菌目 (Pezizales),皮盘菌科(Dermateaceae),眼斑菌属(Oculimacula)。 传播途径:主要通过种子间混杂的病残体及土壤进行远距离传播。 小麦基腐病菌的其他信息见附录A。 5 原理 根据小麦基腐病菌在寄主上的为害症状、分离培养性状、病原菌的形态特征、常规PCR检测结 果,对小麦基腐病菌鉴定结果进行综合判定。 6 试剂或材料 6.1 通则 除另有规定外,按照SN/T1538.1的要求配制培养基,试验用水按照GB/T6682。也可使用适宜 1GB/T33117—2026的商业化培养基进行检测。 6.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)及其选择性培养基 马铃薯去皮后洗净,切成小块,称取200g,蒸馏水中煮30min,用4层纱布过滤,加入10g~20g 葡萄糖、17g~20g琼脂,加热使之完全溶解,蒸馏水定容至1000mL,121℃高压灭菌15min。在以上 培养基中加入硫酸链霉素50mg/L~300mg/L、硫酸铜800mg/L~1000mg/L,可作为小麦基腐病菌 的选择性培养基。 6.3 水琼脂培养基(WA) 15g~20g琼脂,加热使之完全溶解,蒸馏水定容至1000mL,121℃高压灭菌15min。 6.4 麦芽提取物琼脂培养基(MEA) 量取500mL蒸馏水加入20g~30g麦芽提取物与15g琼脂,补足水量至1000mL,分装灭菌。 6.5 燕麦琼脂培养基(OA) 称取30g燕麦片,蒸馏水中煮1h,用4层纱布过滤,加入17g~20g琼脂,加热使之完全溶解,蒸 馏水定容至1000mL,121℃高压灭菌15min。 7 仪器设备 7.1 电子天平。 7.2 体视显微镜。 7.3 生物显微镜。 7.4 培养箱。 7.5 全自动核酸提取仪。 7.6 PCR仪。 7.7 电泳仪。 8 取样 口岸查验进出境植物及其产品时,按照SN/T2122对样品进行现场抽样与取样,对获得的可疑植 物病残体和土壤应送实验室做进一步检测。 9 试验步骤 9.1 症状检查 优先筛选抽样获得的可疑植物病残体和土壤并开展针对性检查:种子样品重点检查是否附着病残 体、土壤颗粒,病残体样品重点筛选变色、带有疑似病斑或子座的组织;植株样品重点检查距离地面 0cm~10cm的叶鞘和茎秆部位,核查是否存在典型病斑(见附录A)。 2GB/T33117—20269.2 分离培养 9.2.1 种子样品 称取50g待检种子,放入250mL无菌三角瓶,加入100mL蒸馏水和1滴~2滴聚山梨酯20 (Tween20),铝箔纸封口后,置于往复式振荡器低速振荡洗涤5min;洗涤悬浮液经干净纱布过滤后注 入刻度离心管,1000r/min离心3min,倾去上清液,合并所有洗涤悬浮液重复离心,收集沉淀物;将沉 淀物移入2mL离心管,12000r/min离心10min,去除上清液,常温风干沉淀后,无菌水10倍稀释并 涂抹在选择性培养基平板置于20℃培养箱培养7d~14d,观察菌落生长情况。 9.2.2 病残体样品 将经症状检查筛选的可疑变色组织剪成3mm~5mm小段,70%(体积分数)乙醇浸泡30s,再用 1%次氯酸钠溶液消毒5min,灭菌水清洗3次、无菌滤纸吸干水分后接种至PDA平板;平板置于20℃ 培养箱培养7d~14d,观察菌落生长情况。 9.2.3 土壤样品 称取2g土壤放入200mL无菌水,磁力棒搅拌30min混匀,将悬浮液稀释10倍后,取1mL涂布 于选择性培养基;平板置于20℃培养箱培养7d~14d,观察菌落生长情况。 9.2.4 分生孢子的诱导 对9.2.1、9.2.2、9.2.3中获得的菌丝,采用水琼脂培养基(WA,制备符合附录B要求)诱导产孢:将 2周龄菌丝接种至WA培养基,9℃培养7d~9d产生分生孢子;取菌丝接种于PDA上或孢子悬浮液 涂布于PDA表面,18℃~21℃培养4d,获得更多分生孢子。将诱导产生的分生孢子用无菌水冲洗并 适当稀释,之后分别进行制片观察(显微形态)和菌株纯化。 9.3 分子生物学检测 9.3.1 DNA提取 适用于种子、病残体、土壤样品及9.2.1、9.2.2、9.2.3中分离获得的菌丝,提取方法可选用十六烷基 三甲溴化铵(CTAB)方法、商业化试剂盒或全自动核酸提取仪,具体操作步骤按附录B。 9.3.2 PCR检测 以提取的总DNA为模板,采用小麦基腐病菌特异性引物进行PCR扩增,具体操作步骤按附录B。 10 鉴定特征 10.1 培养性状 PDA培养基上,菌落呈鹅绒状或细棉状,初期凸状、圆形光滑,边缘平坦,中央气生菌丝明显,表面 灰绿色,背面暗色(见附录C)。 10.2 病原菌形态特征 10.2.1 菌丝特征 病菌菌丝存在两种类型:黄褐色线性分枝营养菌丝,及暗色厚壁、由膨大多角形细胞构成的子座状 3GB/T33117—2026菌丝团。 10.2.2 无性态特征 分生孢子梗对生分枝、透明,具0个~3个隔膜;产孢细胞亚圆柱形至倒瓶状,大小(9μm~ 23μm)×(2.5μm~5μm);分生孢子透明光滑、细长直或略弯,顶端尖锐、基部平截,含3个~7个隔 膜,大小(21μm~58μm)×(1.5μm~2μm)(见附录C)。 10.2.3 有性态特征(不常见) 子囊盘直径0.5mm~1.5mm,无柄密集聚生;子囊(37μm~60μm)×(4μm~6μm),内含8个子 囊孢子;子囊孢子(7μm~11μm)×(1.5μm~2μ