! 7 ,     江苏省市场监督管理局 发　布 中 国 标 准 出 版 社 出　版饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫 的核酸检测　重组酶介导等温核酸 扩增法CCS C 62ICS 11.020 DB32/T 5362— 2026-04-03 ·¢²¼ 2026-05-03 ʵʩ2026 Detection of cryptosporidium and giardia lamblia in drinking water — Recombinase⁃aided amplification assy前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4 仪器与设备 ………………………………………………………………………………………………… 1 5 试剂与材料 ………………………………………………………………………………………………… 2 6 水样富集和核酸提取 ……………………………………………………………………………………… 2 7 核酸检测 …………………………………………………………………………………………………… 3 8 结果判定 …………………………………………………………………………………………………… 4 附录 A（规范性） RAA基础反应体系溶液 ………………………………………………………………… 5 附录 B（规范性） 隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA扩增特异性基因的引物和探针 …………………… 6 附录 C（规范性） 隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫 RAA扩增反应体系 ……………………………………… 7 参考文献 ………………………………………………………………………………………………………DB32/T 5362—2026 8目　　次 ⅠDB32/T 5362—2026 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施。 本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口。 本文件起草单位： 江苏省血吸虫病防治研究所。 本文件主要起草人： 曹俊、 戴洋、 丁昕、 姚甲凯、 陈玉英、 张强、 倪碧娴、 王强、 刘东阳。 Ⅲ饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫 的核酸检测　重组酶介导等温核酸DB32/T 5362—2026 扩增法 1 范围 本文件描述了重组酶介导核酸 等温扩增法检测饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫 。 本文件适用于各类出厂水和末梢水的检测与监测工作 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 隐孢子虫 Cryptosporidium 属于真球虫目 ，隐孢子虫科 ，隐孢子虫属的重要的机会致病性原虫 。 注1： 生活史有滋养体 、裂殖体、配子（体） 、合子和卵囊 5个发育阶段 ，其中卵囊是感染阶段 ，可存在于饮用水中 。 注2： 感染人体后 ，主要寄生于小肠上皮细胞的刷状缘纳虫空泡内 ，可引起隐孢子虫病 。 3.2 蓝氏贾第鞭毛虫 Giardia lamblia 贾第鞭毛虫 ，属于双滴虫目 ，六鞭毛科 ，贾第鞭毛虫属 。生活史包括滋养体和包囊 2个发育阶段 ，其 中包囊是感染阶段 ，可存在于饮用水中 。感染人体后 ，主要寄生于人体十二指肠 、小肠上端和胆囊 ，可引 起蓝氏贾第鞭毛虫病 。 注： 贾第鞭毛虫 简称蓝氏贾第鞭毛虫 ，又称肠蓝氏贾第鞭毛虫或十二指肠蓝氏贾第鞭毛虫 。 3.3 重组酶介导等温核酸扩增技术 Recombinase⁃aided amplification ；RAA 一种利用重组酶 、单链结合蛋白和 DNA聚合酶在等温条件下 （一般为 39 ℃）进行核酸扩增的技术 。 注：　 其原理为重组酶与引物紧密结合扫描双链 DNA，当搜索到与引物同源的序列时 ，使双链 DNA解旋，单链结合 蛋白防止单链 DNA复性，引物在与 DNA聚合酶作用下沿模板延伸 ，合成新的 DNA互补链，5 min~ 15 min就 可实现用仪器检测目的靶标的扩增 。 4 仪器与设备 4.1 水样富集装置 该方法所 需装置如下 ： 1a）过滤器：用于进出 水样和承载固定滤膜 ； b）滤膜：聚丙烯（Polypropylene ，PP）纤维滤膜 ，孔径 1 μm~2 μm，直径 8 cm~ 10 cm； c）橡胶软管 ； d）快速接头 /口：用于连接各部分组件 ； e）流量计。 4.2 DB32/T 5362—2026 核酸提取设备 该方法所需设备如下 ： a）恒温水浴锅 ：可加热至 100 ℃； b）高速离心机 ：相对离心力 ≥12 000 g； c）超声破碎仪 ：≥20 kHz，500 W~ 700 W； d）微量可调移液器 ：量程为 100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、2 μL~20 μL、0.5 μL~10 μL以及 0.1 μL~2.5 μL。 4.3 核酸检测设备 该方法所需设备如下 ： a）RAA恒温核酸扩增检测仪 ：带有恒温 （39±1）℃扩增功能 、荧光定量系统及计算机处理系统的 荧光检测仪 。需具备 FAM（6⁃羧基荧光素 ）和HEX（六氯 ⁃6⁃甲基荧光素 ）两种荧光通道 ； b）恒温震荡混匀仪 ：带有恒温功能 （39±1）℃，且能把固体 、液体物质充分混匀 ，用于核酸样本和反 应试剂的恒温混合 ； c）离心机：相对离心力 ≥12 000 g； d）微量可调移液器 ：量程为 100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、2 μL~20 μL、0.5 μL~10 μL以及 0.1 μL~2.5 μL。 e）掌式离心机 ：0 r/min~ 2 000 r/min。 5 试剂与材料 5.1 试剂 组织核酸提取试剂盒 、RAA基础反应体系溶液 （也可采用等效的扩增反应试剂盒 ） ：见附录 A的表 A.1。乙酸镁溶液 （140 mmol/L ） ，无水乙醇 ，试验用水 （符合 GB/T 6682要求） 。 5.2 材料 离心管（50 mL、15 mL、1.5 mL） 、PCR管（0.2 mL）及管架、微量可调移液器及配套吸头 、培养皿、眼 科剪、眼科镊、一次性医用手套和一次性医用口罩 。 5.3 引物和探针 扩增隐孢子虫属特异性的 18S rRNA 基因以及蓝氏贾第鞭毛虫 β⁃贾第素（β⁃giardin）基因的特异性 引物及探针 ，见附录 B的表 B.1。 6 水样富集和核酸提取 6.1 水样富集 6.1.1 样本及采样量 样本包括自来水厂出厂水 、末梢水，且不低于 50 L。 26.1.2 DB32/T 5362—2026 采样 富集过程采用滤膜拦截过滤的方法 ，利用自来水压完成富集 ，按以下步骤采样 ： a）将滤膜安置固定于过滤器进水口侧 ； b）将过滤器前后组装完整 ，确保密封 ； c）将组装完毕的过滤器通过快速接头 /口和橡胶软管连接于自来水龙头后 ； d）利用快速接头 /口和橡胶软管将流量计连接于过滤器后面 ； e）记录流量计数值 ，打开水龙头 ，利用自来水压进行过滤富集 ； f）关闭自来水龙头 ，记录流量计数值并计算过滤体积 ； g）将过滤器从连接处卸下 ； h）打开过滤器 ，用镊子夹取滤膜边缘后取出 。 注1： 出厂水是指水源水经水厂集中处理后 ，即将进入输配水网管的水 。 注2： 末梢水是指经过输配水管网输送至用户水龙头的水 。 注3： 本部分富集方法为现场采样 ，采集完毕后将滤膜装入 50 mL离心管中 ，并尽快送至实验室 ，运输条件则需确保 0 ℃~ 4 ℃冷藏。富集完成后需在 24 h内完成核酸提取和检测步骤 。 注4： 加标水样和试验用水分别作为本方法的阳性对照和阴性对照 ，与水样富集步骤一致 。 6.2 核酸提取 按照以下步骤进行核酸提取 ： a）用无菌眼科剪将滤膜剪成碎片 ，装入 15 mL离心管中 ； b）向上述离心管中加入 10 mL溶菌酶（50 mg/mL）和500 μL蛋白酶 k（20 mg/mL） ，充分混匀后置 于水浴锅中 50 ℃孵育 60 min； c）再向上述样品管中加入 1 mL玻璃珠（直径 1mm~ 2 mm） ，并置于超声破碎仪中超声 60 min（超 声功率为 25 kHz ~ 36 kHz） ，工作 10 s间隔 10 s； d）将上述样本置于高速离心机 ，13 000 r/min离心 2 min； e）取离心后的上清液 ，按照组织核酸提取试剂盒的操作说明完成核酸提取 ；提取的核酸进行下一 步核酸检测 ，或保存至 （-20±5）℃备用。 注： 本步骤是为了将蓝氏贾第鞭毛虫包囊和隐孢子虫卵囊囊壁充分破碎 ，以释放内部核酸 。 7 核酸检测 7.1 反应体系 扩增反应体系见附录 C的表 C.1；用双蒸水溶解稀释引物探针至 10 μmol/L。 7