ICS65.020.20 CCSB05 SDYY 团 体 标 准 T/SDYY265—2026 五叶草莓脱毒组培快繁技术规程 Codeofpracticefortissuecultureandrapidpropagationforvirus-free‘Fragaria pentaphyllaLosinsk.’ 2026-04-08发布 2026-05-08实施 山东园艺学会  发布 全国团体标准信息平台 T/SDYY265—2026 I前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东园艺学会提出并归口。 本文件起草单位：青岛农业大学、尚好科技有限公司、山东省农业科学院、青岛市农业技术推广中 心、青岛市农业科学研究院、成县连丰农产品有限责任公司、青岛华垦进出口有限公司、北京大学现代 农业研究院。 本文件主要起草人：郑晓东、王彩虹、郁东兴、王俊峰、刘爱娜、李少旋、于连泽、鲍雯青、田义 轲、赵强、孙志娟、王婵玉、刘萍、张庶、陈立勇、张蕊芬、周军会、梁咏琪、张瑶、孙泽春。 全国团体标准信息平台 T/SDYY265—2026 1五叶草莓脱毒组培快繁技术规程 1范围 本文件界定了五叶草莓组培快繁的术语与定义，规定了外植体构建、初代培养、继代培养、生根培 养、病毒检测等技术要求。 本文件适用于五叶草莓组培苗繁育。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB8599-2023大型压力蒸汽灭菌器技术要求 DB13/T5110-2019植物组织培养室组建及操作技术规程 3术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 五叶草莓FragariapentaphyllaLosinsk 蔷薇科草莓属，二倍体植物。叶片呈羽状五小叶，质地较厚，小叶片倒卵形或椭圆形。聚伞花序， 白色花瓣，果实呈白色或红色卵圆形，平均单果重为0.8g~1.5g，表面密布棕红色斑点，其种子均凹于 果面。 3.2 脱毒Viruselimination 利用组织培养，去除感染病毒的草莓植株体内所携带的病毒，从而获得无病毒种苗的过程。 3.3 外植体Explant 植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织片段。 4外植体构建 4.1外植体选取 选取健壮无病虫害的草莓植株，剪取当年生匍匐茎。以4月、5月、10月、11月晴天上午取材为宜。 4.2外植体预处理 剪取匍匐茎顶端2cm～3cm，去除叶片和叶柄，用自来水流水冲洗1h，沥干备用。 4.3外植体消毒 4.3.1前期准备 用75%酒精擦拭超净工作台台面，清除灰尘和杂物，紫外灯照射灭菌30min～60min，之后通风10 min。镊子、刀片、三角瓶等工具高温高压灭菌锅121℃灭菌25min，冷却后备用。 4.3.2快速灭菌 全国团体标准信息平台 T/SDYY265—2026 2在超净工作台中将预处理后的匍匐茎放入无菌三角瓶，倒入75%乙醇，浸泡30s，期间轻轻摇晃三 角瓶。然后倒出乙醇，立即用无菌水冲洗外植体3次，每次1min～2min。 4.3.3深层灭菌 在三角瓶中倒入适量有效氯含量为1%的NaClO溶液，溶液应没过外植体，浸泡5min～6min，期间 轻轻摇晃三角瓶。然后倒出消毒剂，用无菌水冲洗外植体5次，每次2min～3min，期间轻轻摇晃三角 瓶，减少消毒剂残留。 5初代培养 5.1激素的母液配制 将所需的6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、吲哚丁酸（Indole-3-butyricAcid，IBA） 用1mol/LNaOH溶解，再用蒸馏水稀释后分别配制成0.1mg/mL的母液，装入棕色广口瓶中，置于4℃冰 箱保存。 5.2初代培养基制备 按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入Murashige&Skoog培养基（M519干粉）、3%蔗糖，稍加 热搅拌至完全溶解。溶解后加入0.5mg/L6-BA和0.1mg/LIBA，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节 pH至5.8～6.0。随后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25min后分装备用，灭菌 锅使用符合GB8599-2023要求。 5.3茎尖接种 在解剖镜下，用镊子逐层剥去小叶，直至露出半球形的生长点，用刀片切取0.2mm～0.5mm茎尖， 生长点朝上接种在初代培养基上，一瓶接种3个～4个生长点为宜。 5.4接种后管理 接种后，将培养瓶置于培养室培养，温度20℃～23℃，光照强度2000lx，日均光照时长12h/d，培 养室环境符合DB13/T5110-2019要求。 6继代培养 6.1继代芽体选择 从初代接种日起算，培养30d～40d后，茎尖分化出不定芽，形成2cm～3cm高的丛生芽时可进行 继代增殖。 6.2继代培养基制备 按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入M519干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加入 6-BA母液至终浓度0.5mg/L和IBA母液至终浓度0.03mg/L，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节pH至 5.8～6.0。随后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25min后分装备用。 6.3继代苗接种 用无菌手术刀将单株苗从基部切下，去除愈伤，保证切口平整，避免撕裂，并将单株苗转接至继代 培养基中。需注意的是，继代次数不宜超过7次，总培养时长不超过1年，以防止组培苗发生变异。 6.4接种后管理 接种后将组培苗置于光照强度2000lx、日均光照时长12h、温度24℃～26℃、湿度60%～70%的培 养室中培养。 7生根培养 全国团体标准信息平台 T/SDYY265—2026 37.1生根培养基制备 按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入M519干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解。溶解后加 入0.3mg/LIBA，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节pH至5.8～6.0。完全溶解后加入0.7%琼脂并充 分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25min后分装备用。 7.2生根苗的选取与处理 从继代培养苗中，挑选健壮、无畸形、高度2.5cm～3cm、带2片～3片展叶的单株苗，避免选用弱 小苗、黄化苗和玻璃化苗。用无菌手术刀将单株苗从基部切下，保证切口平整，避免撕裂茎秆，若基部 带有愈伤组织，需切除多余愈伤。 7.3接种后管理 接种后将组培苗置于光照强度3000lx、日均光照时长14h、温度24℃～26℃、湿度60%～70%的组 培室中培养。从接种日起算，当生根至第35d～45d时，根系健壮、有分支，根数3条以上时，苗高2.5cm～ 3cm、带2片～3片展叶时可进行驯化，驯化前需提前5d～7d开盖炼苗，逐步降低湿度，提高移栽成活 率。 8病毒检测 8.1检测方法 在组培苗生根培养驯化前进行病毒检测，每批次组培苗随机抽取5%～10%的样本，采用RT-PCR（逆 转录—聚合酶链式反应）检测。 8.2检测步骤 8.2.1RNA提取 在超净工作台上切取五叶草莓组培苗叶片0.1g～0.2g，放入无菌无酶的2ml离心管，并放入1个 钢珠做好相应标记，迅速置于液氮中备用。将样品放入组织研磨机中，研磨频率70Hz，研磨时间90s。 按照试剂盒步骤（山东思科捷生物技术有限公司，新型植物RNA快速提取试剂盒，货号：AC0305）， 提取总RNA。 8.2.2反转录 按照试剂盒步骤（山东思科捷生物技术有限公司，SPARKscriptⅡRTPlusKit，货号：AC0304）， 得到cDNA模板，置于-20℃暂存备用。 8.2.3PCR检测 用primer5.0软件设计引物序列（参见附录A），在PCR管中依次加入3µLddH2O、0.5µLPrimerF、 0.5µLPrimerR、3µL2×Mix、1µLcDNA并离心混匀，放入PCR仪中，扩增条件设置为94℃预变性 3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，置于4℃冰箱 保存备用。 8.2.4琼脂糖凝胶电泳 吸取5µLPCR产物及Marker点入琼脂糖胶孔中，120V恒压条件下电泳20min。电泳完成后，通 过凝胶成像系统观察目的片段，确认为无病毒，可进行驯化。 全国团体标准信息平台 T/SDYY265—2026 4附录A草莓内参基因与四种主要病毒引物 （资料性附录） 引物名称 引物序列(5′-3′) 目的片段大小 (bp) ActinF:GCTGGGTTTGCTGGAGATG295R:CACGATTAGCCTTGGGATTC SVBVF:GATCTTATCCTTACTCTCGCAAAGA220 R:GAAGCTTGTTTGAAGGCATCAG SMoVF:TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG219 R:TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG SMYEVF:CACCCCGAATCCGAATGTGA444 R:GAGCACGCCATCGAAGAAAT SCVF:CATTGGTGGCAGACCCATCA345 R:TTCAGGACCTATTTGATGACA _________________________________ 全国团体标准信息平台