团 体 标 准 T/QHNX 059 —2026 T/QAS 171 —2026 甘蓝型春油菜小孢子培养及加倍技术规范 2026 - 04 - 09发布 2026 - 04 - 15实施 青海省农学会 发 布 ICS 65.020.20 CCS B 05 T/QHNX 全国团体标准信息平台 T/QHNX 059—2026 T/QAS 171—2026 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由青海大学农林科学院提出。 本文件由青海省农学会归口。 本文件起草单位：青海大学农林科学院、青海互丰农业科技集团有限公司、青海省农业技术推广总 站。 本文件主要起草人：星晓蓉、叶景秀、赵志、李开祥、徐亮、柳海东、贺子腾、许永丽。 全国团体标准信息平台 T/QHNX 059—2026 T/QAS 171—2026 2 甘蓝型春油菜小孢子培养及加倍技术规范 1 范围 本文件规定了甘蓝型春油菜小孢子培养术语和定义，以及供体种植条件、供体种植及取样、培养基 的配置及灭菌、小孢子培养方法、再生植株加倍等技术内容的操作规范及质量要求。 本文件适用于甘蓝型春油菜区育种时使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 DB63/T 943 甘蓝型油菜主要病虫害防治技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 小孢子（Micrre） 高等植物花粉形成过程中，由花粉母细胞经过减数分裂产生的单倍体细胞。 胚状体（Embryoid） 通过离体小孢子培养诱导形成的类胚结构。 再生植株（Regenerated plant） 由胚状体发育而成的完整植株。 4 供体种植条件 供体可种植在大田、温室、人工气候室等场所。大田具备基本的种植土壤及浇灌条件；温室具备供 暖、保温、通风、浇灌设备；人工气候室具备精确的控温、控光系统。 5 供体种植及取样 供体种植 5.1.1 大田 大田供体材料从 3月~5月分批播种，每批材料种植间隔 15d，水肥统一管理，病虫害防治按 DB63/T 943规定进行。 5.1.2 温室 温室从9月中下旬开始种植，温度控制在 15℃~25℃，12月中旬开花时，温度控制在 8℃~15℃。水肥 统一管理，病虫害防治按 DB63/T 943 规定进行。 5.1.3 人工气候室 人工气候室全年种植，开花时，温度控制在 10℃~18℃。昼/夜温度设定为 18/10℃。水肥统一管理， 病虫害防治按 DB63/T 943 规定进行。 全国团体标准信息平台 T/QHNX 059—2026 T/QAS 171—2026 3 取样 5.2.1 取材时间 供体植株初花至盛花期取样，选取健康植株的主花序或生长状态较好的分支花序，用冰盒运送至培 养基地。 5.2.2 小孢子发育时期确定 选取大小 2.5 mm~3.2 mm 的花蕾。通过镜检，选取单核晚期至双核早期的小孢子。 5.2.3 花蕾消毒 a) 用有效氯成分 4.5%~5.5% 的消毒液（ 84液），表面消毒 15 min，然后用无菌水清洗 3次，每 次5 min。 b) 用75%的酒精表面消毒 1min，再用升汞消毒 8~10min，最后用无菌水清洗 3次，每次 5 min。 6 培养基的配置及灭菌 配置 见附录A。 灭菌 6.2.1 抽滤灭菌 NLN-13培养基应抽滤灭菌。 先用真空泵和抽滤罐， 分别用 0.8 m，0.22 m孔径的混合纤维素酯膜 （ MCE） 对培养基进行初步过滤， 再通过无菌过滤器和蠕动泵，过滤、 分装到无菌容器中， 25℃静置24h后使用。 6.2.2 高温高压灭菌 B5-13、B5、MS培养基，应采用高温高压灭菌， 121℃，103.4kPa，20min。 7 小孢子培养方法 小孢子提取 步骤如下： 1) 将表面清洗消毒后的花蕾放置于离心管中，加入 30mL~40mL B5-13 分离洗脱培养基，用 玻璃棒研磨使花粉散出。 2) 将花粉悬浮液倒入过滤器（小漏斗和 300目尼龙纱网组成），滤入 50ml 离心管。 3) 800~1000 rpm/min ，离心4min，弃上清液，再加入 30mL~40mL B5-13 洗脱液，重复洗脱 至少 2次。 胚诱导培养 步骤如下： 1) 用NLN-13培养基将收集到小孢子进行稀释， 并分装到 9 cm培养皿中， 每皿 15mL~20mL ， 用封口膜封口。 2) 32℃黑暗热激培养 48h，然后静置在 25℃恒温条件下进行暗培养。 3) 10~12d左右肉眼可见胚状体形成，移至 50 rpm/min 、25℃恒温摇床上继续进行振荡暗培 养。 胚状体冷处理 将发育至 5mm~10mm 的子叶型胚放置在 4℃条件下，处理 20d。 再生植株的诱导培养 全国团体标准信息平台 T/QHNX 059—2026 T/QAS 171—2026 4 将经过低温处理的子叶型胚接种在 B5固体培养基上，于 25℃，16 h光/8 h暗，2000 LUX 光强条件下 培养。 再生植株的继代培养 切取胚状体上的再生植株的生长点，接种在 MS固体培养基上继代培养。 8 再生植株加倍 土壤基质 再生苗移植前施肥，平均每亩施有机肥 160.00kg/667m2。 栽培及壮苗 再生苗在 MS培养基上生长 30d后， 可移栽到温室土壤中。 移栽初期需要用遮阴网和透明塑料杯遮光、 保湿。练苗 15d后，揭开遮阴网和杯子，使其在自然光照下生长。单倍体植株长出 3~5片新叶时，进行染 色体加倍。 单倍体苗加倍 将植株挖出，洗净根部泥土，在浓度 0.3%的秋水仙碱溶液中，浸根 7h。然后，将植株根部残留的秋 水仙碱用流水冲洗干净，重新栽种到土壤中，灌透水，并遮光、缓苗。 施肥管理 缓苗15d后，取开遮阴网，松土、除草、去黄叶、死叶，并追施尿素 3.00kg/667m2。开花后，及时拔 除未能加倍的植株，再追施尿素 4.00kg/667m2，加倍正常植株套袋留种。 病虫害防治 主要病害为白粉病，虫害为小菜蛾和蚜虫，防治方法按 DB63/T 943 执行。 全国团体标准信息平台 T/QHNX 059—2026 T/QAS 171—2026 5 附 录 A （规范性） 培养基配方 培养基配方见表 A.1 表A.1 培养基配方表 名称 药品用量 g/L 蔗糖用量 g/L 琼脂用量 g/L PH 值 B5-13培养基 3.21 130.00 0.00 5.8~6.0 NLN-13培养基 1.77 130.00 0.00 B5固体培养基 3.21 20.00 12.00 MS固体培养基 4.43 30.00 12.00 全国团体标准信息平台