ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 381—2026 犬贫血相关六种病原体实时荧光 RAA 检测方法 Real-time RAA detection method for six canine anemia-associated pathogens 2026 - 4 - 1发布 2026 - 4 - 1实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 381—2026 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 浙江农林 大学提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 浙江农林大学动物科技学院动物医学院、杭州迅灵生物科技有限公司、杭州领与 众创生物科技有限公司、山东远大富邦生物工程有限公司 。 本文件主要起草人： 谢作缎、吴芹、孙静、邵春艳、 崔心江、 陈中炜、 付玉和、林淦、唐浩、 王佳 慧、胡彬、 谢铭。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 381—2026 1 犬贫血相关六种病原体实时荧光 RAA检测方法 1 范围 本文件规定了引起犬贫血的 犬巴贝斯焦虫 、吉氏巴贝斯虫、犬支原体、犬嗜吞噬细胞无浆体、犬肝 簇虫、犬埃里希氏体六种病原体的荧光 RAA检测方法。 本文件适用于犬巴贝斯焦虫 、吉氏巴贝斯虫、犬支原体、犬嗜吞噬细胞无浆体、犬肝簇虫、犬埃里 希氏体六种病原体 的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改 单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 动物检疫 实验室质量控制规范 兽医学检测 NY/T 541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1：黑洞淬灭基团 1（black hole quencher 1 ） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（ cetyltrimethylammonium bromide ） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） EDTA：乙二胺四乙酸（ ethylene diamine tetraacetic acid ） FAM：6-羧基荧光素（ 6-carboxyfluorescein ） MMLV：莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒（ moloney murine leukemia retrovirus ） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate -buffered saline buffer ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ） RAA：重组酶介导链替换核酸扩增（ recombinase -aid amplification ） Tris：三（羟甲）基氨基甲烷（ tri-methylolaminomethane ） 5 试剂和材料 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 381—2026 2 5.1 试剂 5.1.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求 ，所有试剂均 用无 RNA酶的容器分装 。 5.1.2 CTAB提取缓冲液按附录 A.1配制。 5.1.3 核酸抽提液按附录 A.2配制。 5.1.4 异丙醇。 5.1.5 70 %（体积分数）乙醇 。 5.1.6 TE缓冲液按附录 A.3配制。 5.1.7 PBS缓冲液按附录 A.4配制。 5.1.8 启动剂按附录 A.5配制。 5.1.9 商品化 RAA荧光反应单元：包含重组酶、单链结合蛋白、 DNA聚合酶的冻干粉 。 5.1.10 犬巴贝斯焦虫、吉氏巴贝斯虫、犬支原体、犬嗜吞噬细胞无浆体、犬肝簇虫、犬埃里希氏体 的 阳性对照的制备见附录 A中A.6。 5.1.11 阴性对照为已知 犬巴贝斯焦虫、吉氏巴贝斯虫、犬支原体、犬嗜吞噬细胞无浆体、犬肝簇虫、 犬埃里希氏体 阴性的犬全血样本。 5.2 引物和探针 5.2.1 犬巴贝斯焦虫 荧光 RAA的引物探针按照附录 B中表 B.1， 特异性扩增片段序列见附录 C中C.1。 5.2.2 吉氏巴贝斯虫 荧光 RAA的引物探针按照附录 B.2，特异性扩增片段序列见 附录 C.2。 5.2.3 犬支原体 荧光 RAA的引物探针按照附录 B.3，特异性扩增片段序列见 附录 C.3。 5.2.4 犬嗜吞噬细胞无浆体 荧光 RAA的引物探针按照附录 B.4，特异性扩增片段序列见附录 C.4。 5.2.5 犬肝簇虫 荧光 RAA的引物探针按照附录 B.5，特异性扩增片段序列见附录 C.5。 5.2.6 犬埃里希氏体 荧光 RAA的引物探针按照附录 B.6，特异性扩增片段序列见附录 C.6。 6 仪器设备 6.1 恒温荧光检测仪。 6.2 超微量分光光度计。 6.3 冷冻高速离心机。 6.4 微量移液器：量程 0.5 µ L ~ 10 µ L ，10 µ L ~ 100 µ L ，20 µ L ~ 200 µ L ，100 µ L ~ 1000 µ L 。 6.5 涡旋振荡器。 6.6 金属浴。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 381—2026 3 6.7 纯水仪。 6.8 冰箱： 2 ℃ ~ 8 ℃，-20 ℃或-80 ℃。 7 样品采集、运输与保存 7.1 样品采集运输 样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 执行。使用含 EDTA抗凝剂的采血管从临床疑似病例犬的前 肢皮下头静脉采集 200 µ L ~ 300 µ L 血液并上下颠倒不少于 5次，充分混匀。样品编号并填写相应采样单， 样品尽快送检，送检时添加冰袋，保持低温 。 7.2 样品处理 实验室生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 全血样品按 NY/T 541中6.1.3.1的规定执行。 7.3 样品保存 用于核酸检测的样品应尽快送检， 24 h内的样本可置于 4 ℃保存， 24 h内无法检测的样本应置于 -80 ℃保存，如无 -80 ℃条件，则置于 -20 ℃冰箱保存，保存时间不得超过两个月。 8 操作方法 8.1 核酸提取 8.1.1 在样本制备区进行，核酸提取使用 CTAB法提取，也可采用其他等效核酸提取方法。 8.1.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用 n表示，取 n个灭菌 1.5 mL离心管，逐管编号。 8.1.3 取200 µ L样品加入 600 µ L CTAB 提取缓冲液，涡旋振荡混匀后于 70 ℃孵育 15 min，期间颠倒 离心管 2 ~ 3次。 12000 r/min离心 5 min，取上清液于一新的 1.5 mL离心管中。 8.1.4 加入 500 µ L核酸抽提液，上下颠倒离心管 2 ~ 3次后涡旋振荡混匀， 12 000 r/min 离心 5 min； 转移上层水相至一新的 1.5 mL离心管中。 8.1.5 加入 0.7倍体积异丙醇，轻柔颠倒离心管 2 ~ 3次， 4 ℃静置 30 min，4 ℃下12000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液。 8.1.6 加入 700 µ L 70 % （体积分数）乙醇，重悬沉淀， 12000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液。 8.1.7 开盖，室温挥发干液体，加入 50 µ L TE 缓冲液溶解核酸，可直接进行检测或 -80 ℃保存。 8.2 扩增试剂的准备与配置 8.2.1 在试剂储存和准备区进行。 8.2.2 扩增反应体系： 犬巴贝斯焦虫、吉氏巴贝斯虫、犬支原体、犬嗜吞噬细胞无浆体、犬肝簇虫、 犬埃里希氏体 的RAA反应体系见附录 D中表 D.1。根据 8.1.2中提到的 n值，按照 n+1分别配制 六种 反应体系，充分混匀后分装，每个反应管 20 µ L，转移至样本制备区。 8.3 加样 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 381—2026 4 8.3.1 在样本制备区进行。 8.3.2 每个反应管盖加入 5 µL提取的核酸，加样顺序为阴性对照、样本、阳性对照，记录反应管对应 样本编号，盖紧管盖后，转移至样本扩增区。 8.4 荧光RAA反应 8.4.1 在样本扩增区进行。 8.4.2 将8.3加样后的反应管瞬时离心混匀后放入恒温荧光检测仪中，设置选定 FAM作为报告基团 , 选择 None作为淬灭基团， 荧光 RAA反应程序 见附录 D.2。 9 结果判定 9.1 质量控制