ICS65.020.30 CCSB43 NXSLX 宁夏饲料工业协会团体标准 T/NXSLX0207—2025 牛体细胞体外培养与冷冻保存操作规程 Operatingrulesforinvitrocultureandcryopreservationofbovinesomaticcells 2025-11-7发布 2025-12-7实施 宁夏饲料工业协会  发布 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0207—2025 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草 规则》的规定起草。 本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由宁夏大学提出。 本文件由宁夏饲料工业协会归口。 本文件起草单位：宁夏大学、宁夏农林科学院动物科学研究所、吉林农业大学、西北 农林科技大学、海原县科学技术局、固原富民农业科技发展有限公司 本文件主要起草人：魏大为、姜超、张久盘、宋雅萍、马云、张娟、房义、黄永震、 田平、张令锴、胡亚美、聂路玮、焦若普、杨东梅、龚红芳、马艺伦、何学亮、咸海龙 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0207—2025 1牛体细胞体外培养与冷冻保存操作规程 1.范围 本文件规定了牛体细胞（主要为耳缘组织成纤维细胞）体外培养与冷冻保存操作的术 语和定义、技术要求、质量检测、记录档案管理和注意事项。 本文件适用于牛体细胞分离培养与冷冻保存操作。 2.规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其最新版本 适用于本文件（注：本文件中所涉及到的所有技术规程均遵循中华人民共和国生物安全法， 且相关动物实验按照GB/T35892标准执行）。 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T35892实验动物福利伦理审查指南 GB/T42466生物样本库多能干细胞管理技术规范 GB/T24863畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程 NY/T1900畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 3.术语和定义 GB/T24863和NY/T1900界定的术语和定义适用于本文件。 4.技术要求 4.1组织样本采集 4.1.1牛只准备 确认牛只身份，记录品种、年龄、性别等信息。 4.1.2组织采集 按照GB/T24863的规定对牛耳缘组织进行消毒处理，然后用无菌活检打孔器（直径 6-8mm）或无菌手术剪采集组织块，用无菌纱布按压伤口止血。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0207—2025 24.1.3样本处理 样本组织块用75%酒精涮洗30s后，用无菌且含5%双抗（青霉素、链霉素）的PBS溶液 清洗3遍，再将组织放入预冷的、含2%双抗的PBS溶液的无菌离心管中保存。 4.1.4样本运输 在4℃条件下尽快运送至实验室，最长不应超过24h。 4.2原代细胞培养 4.2.1准备操作 所有操作均在无菌环境中进行，使用无菌器械和耗材。 在培养皿中用含3%双抗的PBS溶液反复冲洗组织块，直至清洗液清澈。 4.2.2组织块法分离 将组织块剪成约1mm³的小块，均匀贴附于细胞培养瓶底，翻转培养瓶使组织块在上， 于37℃、5%CO₂培养箱中培养4～6h，待组织块稍干涸贴壁后，轻轻翻转培养瓶，加入 完全培养基（10%FBS+1%双抗+89%DMEM/Highglucose），使其完全覆盖组织块。此时记 为分离第0天，继续培养1周左右，少量成纤维细胞从组织块边缘迁出，在分离第10天左右， 组织块四周均出现细胞时，去除组织块，更换新鲜培养基继续培养，之后每2天更换一次 培养基。 4.2.3酶消化法分离 使用胶原酶I（0.1%～0.2%浓度）在37℃消化组织块1～2h，加入含20%胎牛血清（FBS） 的高糖DMEM培养基终止消化，离心收集细胞沉淀，用完全培养基重悬，并接种于培养瓶中， 培养16h后，更换培养基，观察细胞形态。 4.3传代培养 当细胞融合度达到80%～90%时进行传代。弃去旧培养基，用PBS清洗细胞一次。加入 适量0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化1～3min。在显微镜下观察到细胞变圆、间隙增 大时，立即加入含血清的完全培养基终止消化，吹打培养瓶底壁，制成单细胞悬液。将细 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0207—2025 3胞悬液移入离心管，1000rpm离心5min。弃去上清，用新鲜完全培养基重悬细胞。按1： 2至1：3的比例将细胞悬液接种到新的培养瓶中，补充足量培养基，放入CO₂培养箱，每2 天更换一次培养基。 4.4细胞冷冻保存 4.4.1细胞冻存操作 选择对数生长期、状态良好的低代次细胞（建议在第3～5代进行冻存）。预先配制细 胞冻存液（DMEM/Highglucose：FBS：DMSO=7：2：1）。按传代方法消化并收集细胞， 计数确定细胞活率和浓度。将细胞沉淀用冻存液重悬，调整浓度至1×106～5×106cells/mL。 将1.0～1.5mL细胞悬液分装至标注清晰的专用细胞冻存管中（标注内容：牛只ID、代次、 冻存日期）。 4.4.2细胞冻存方式 若有程序降温盒，将冻存管立即放入充满异丙醇的程序降温盒中，于-80℃冰箱中放 置18～24h，使细胞以约-1℃/min的速率缓慢降温；若无程序降温盒，可采用分层降温法： 4℃30min→-20℃2h→-80℃过夜。24h内将冻存管从-80℃转移至液氮罐中长期 保存。 4.5细胞复苏 从液氮罐中迅速取出目标冻存管，立即放入37℃水浴锅中，持续轻柔摇晃，使其在1min 内完全融化。用酒精消毒冻存管外壁，在安全柜中打开。将细胞悬液缓慢转移至含5mL预 温完全培养基的离心管中，轻柔混匀，1000rpm离心5min，弃去上清液以去除残留的DMSO。 用新鲜完全培养基重悬细胞，接种至培养瓶/皿中，放入CO2培养箱培养。24h后更换一次 培养基，以进一步去除死细胞和碎片。 5.质量检测 无菌检测：定期取培养上清液进行细菌、真菌和支原体检测。 细胞鉴定：可通过形态学观察（成纤维样细胞形态）及种属特异性PCR进行鉴定。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0207—2025 4存活率检测：冻存前和复苏后均需使用台盼蓝染色法进行细胞活率计数，复苏后活率 应高于85%。 6.记录档案管理 参考GB/T42466，详细记录每份样本的供体牛信息、细胞分离日期、冻存情况和复苏 情况，建立电子和纸质双重档案系统，详见附录A。 7.注意事项 操作液氮时需佩戴防冻手套和护目镜，防止冻伤。实验室应保持良好通风，防止液氮 大量蒸发导致缺氧。 严格遵守GB19489的生物安全规程，妥善处理废弃物及污染材料。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0207—2025 5附录A （资料性） 表1牛成纤维细胞冻存和复苏记录表 供体牛信息 细胞分离日期 冻存情况 序号冻存管号代次数量密度冻存时间液氮罐号提漏号层号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 复苏情况 序号冻存管号 冻存时间 复苏时间细胞复苏状态备注 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 全国团体标准信息平台