ICS11.020 CCSC62 DB36 江西省地方标准 DB36/T2206—2025 汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR 检测方法 Duplexreal-timeRT-PCRdetectionmethodforHantaanvirusandSeoulvirus 2025-12-29发布2026-07-01实施 江西省市场监督管理局发布DB36/T2206—2025 I目  次 前言.................................................................................II 1范围...............................................................................1 2规范性引用文件.....................................................................1 3术语和定义.........................................................................1 4缩略语.............................................................................1 5仪器设备...........................................................................2 6试剂和材料.........................................................................2 7生物安全要求.......................................................................2 8检测步骤...........................................................................2 9结果判定...........................................................................3 附录A（规范性）汉滩病毒和汉城病毒检测靶标基因序列...................................4 附录B（资料性）灭菌PBS溶液的配制...................................................5 附录C（规范性）引物与探针序列.......................................................6 附录D（资料性）双重实时荧光RT-PCR检测反应体系和反应条件............................7 参考文献..............................................................................8DB36/T2206—2025 II前 言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省卫生健康委员会提出。 本文件由江西省卫生健康标准化技术委员会(JX/TC037)归口。 本文件起草单位：江西省疾病预防控制中心、宜春市疾病预防控制中心、南昌市疾病预防控制中心、 上饶市疾病预防控制中心、高安市人民医院、高安市疾病预防控制中心、丰城市疾病预防控制中心。 本文件主要起草人：刘师文、李健雄、施勇、徐刚、张艳妮、张红波、邱伟华、肖芳、钱科、尤晨、 刘晓庆、雷锦辉、陈勇、丁欣悦、周珺、肖大瑾、冉鑫、吴杨博文、王倩、熊英。DB36/T2206—2025 1汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法 1范围 本文件规定了汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测的仪器设备、试剂和材料、生物安全 要求、检测步骤和结果判定等内容。 本文件适用于啮齿类动物汉滩病毒和汉城病毒的双重实时荧光RT-PCR检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 汉滩病毒Hantaanvirus(HTNV) 引起肾综合征出血热的病原体之一，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，自然宿主主要为黑线姬 鼠。 3.2 汉城病毒Seoulvirus(SEOV) 引起肾综合征出血热的病原体之一，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，自然宿主主要为褐家鼠。 3.3 实时荧光RT-PCRreal-timeRT-PCR 在常规逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的基础上，加入一条特异性探针，探针两端分别标记一个荧 光报告基团和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；在聚合酶 链式反应(PCR)过程中，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团 分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接收。利用荧光信号累积实现实时在线监测整个PCR 反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。 4缩略语DB36/T2206—2025 2下列缩略语适用于本文件。 RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) PBS：磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline) RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction) PCR：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) Ct值：实时荧光RT-PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle thresholdvalue) FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein） HEX：六氯-6-甲基荧光素（Hexachlorofluorescein） 5仪器设备 5.1荧光定量PCR仪。 5.2低温高速离心机：可控温度至4℃，相对离心力可达8000g以上。 5.3组织研磨仪。 5.4生物安全柜。 5.5冰箱：普通冰箱（2℃~8℃）、超低温冰箱（-70℃~-86℃）。 5.6微量移液器：量程规格分别为0.5μL~10μL、2μL~20μL、5μL~50μL、20μL~200μL、 100μL~1000μL。 5.7压力蒸汽灭菌器。 5.8核酸提取仪。 6试剂和材料 6.1试剂 6.1.1除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为GB/T6682规定的一级水。 6.1.2RNA提取试剂。 6.1.3实时荧光RT-PCR反应试剂。 6.1.4阴性对照和阳性对照：阴性对照样品为水，汉滩病毒和汉城病毒的阳性对照为含有检测靶标基 因序列（附录A）的质粒水溶液。 6.1.5灭菌PBS溶液，按照附录B规定进行配制。 6.2材料 6.2.1无菌冻存管：2mL。 6.2.2离心管:无RNA酶，1.5mL。 6.2.3PCR扩增反应管：0.2mL。 6.2.4剪刀：10cm眼科弯剪。 7生物安全要求 本实验操作的生物安全应符合GB19489的规定。 8检测步骤DB36/T2206—2025 38.1啮齿类动物肺的处理 在生物安全二级实验室的生物安全柜内，采用无菌剪刀、剪取0.2g~0.5g肺脏至1.5mL离心管， 加入0.8mL灭菌PBS溶液，采用组织研磨仪进行研磨，研磨操作按照研磨仪说明书执行。将研磨好的样 本于低温高速离心机内4℃，8000g离心10min。取上清液至无菌的冻存管内，编号备用。若48h内进 行检测宜在普通冰箱冷藏保存，若需长期保存，应置于超低温冰箱冷冻保存，避免反复冻融。装有研磨 沉淀的离心管以及其他废弃物应放入压力蒸汽灭菌器高压灭菌，灭菌后按医疗废弃物处理。 8.2样本RNA提取 取100μL~400μL研磨上清液以及阴性对照、阳性对照，按照RNA提取试剂盒使用说明书提取 RNA。 8.3双重实时荧光RT-PCR检测 按照附录C、附录D的规定进行双重实时荧光RT-PCR检测。 9结果判定 9.1成立条件 9.1.1阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线。 9.1.2阳性对照Ct值应≤30，且出现典型扩增曲线。 9.1.3满足9.1.1和9.1.2的规定，方可判定试验成立。 9.2检测结果判定 9.2.1阈值设定 应根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。 9.2.2阴性 双检测通道均应无Ct值，且无典型扩增曲线，判定样本中无汉滩病毒、汉城病毒。 9.2.3双阳性 双检测通道Ct值均应≤35.0，且均出现典型扩增曲线，判定样本中存在汉滩病毒、汉城病毒。 9.2.4单阳性 出现下列情况之一时，判定为单阳性： ——若仅FAM检测通道出现典型扩增曲线，且Ct值≤35.0，而HEX通道无Ct值，且无典型扩增曲 线，判定样品中存在汉滩病毒。 ——若仅HEX检测通道出现典型扩增曲线，且Ct值