ICS 67.160.10 QB 分类号：X62 备案号：46760-2014 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T 4710-2014 发酵酒中尿素的测定方法 高效液相色谱法 Determination of urea in fermented alcoholic beverage-- High performance liquid chromatography 2014-11-01实施 2014-07-09发布 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T4710—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国酿酒标准化技术委员会（SAC/TC471）归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、上海金枫酒业股份有限公司、中国绍兴黄酒集团有限 公司、江苏张家港酿酒有限公司、浙江塔牌绍兴酒有限公司、中国食品有限公司、深圳市华测检测技术 股份有限公司、国家黄酒产品质量监督检验中心、浙江赞宇科技股份有限公司、新华锦（青岛）即墨老 酒有限公司。 本标准主要起草人：钟其顶、俞剑案、邹慧君、黄庭明、单之初、李泽福、万峰、诸葛庆、杨琳、 杜祖远、高红波、胡健、周建弟、周建明、李进、曾金红、汪庆旗、韩吉臣。 QB/T4710-2014 高效液相色谱法 发酵酒中尿素的测定方法 1范围 本标准规定了采用高效液相色谱仪测定发酵酒（黄酒、啤酒）中尿素的方法。 本标准适用于发酵酒（黄酒、啤酒）中尿素的测定，尿素的检出限为0.02mg/L。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 3原理 采用9-羟基占吨衍生剂与发酵酒中的尿素进行衍生反应，尿素衍生产物具有荧光特性，经色谱柱 分离后，可通过荧光检测器测定，外标法定量分析。 4材料与试剂 除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682一2008规定的一级水。 4.1无水乙酸钠。 4.2浓盐酸。 4.39-羟基占吨（不小于98%）。 4.4无水乙醇。 4.5正丙醇。 4.6乙睛：色谱纯。 4.7冰乙酸（不小于99.0%）。 4.8乙酸溶液（1.0%，体积分数）：吸取1.0mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.9乙酸钠溶液（0.02mol/L）：称取1.64g无水乙酸钠溶解于1000mL水中，用乙酸溶液（1.0%， 体积分数）将乙酸钠溶液pH调至7.2。 4.10盐酸溶液（1.5mol/L）：吸取6.2mL的浓盐酸于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.119-基占吨溶液（0.02mol/L）：称取0.198g9-羟基占吨，用正丙醇溶解并定容至50mL容量瓶 中，混匀。在0℃～4℃冰箱避光保存，1个月内使用。 4.12尿素标准品：纯度不小于99%。 4.13尿素标准储备液（1.0mg/mL）：准确称取0.100g尿素标准品，用无水乙醇溶解并定容至100mL 容量瓶中，混匀。在0℃～4℃冰箱保存，1个月内使用。 4.14尿素标准工作液：准确吸取一定体积的尿素标准储备液于容量瓶中，用无水乙醇依次配制成浓度 为2.00mg/L、4.00mg/L、8.00mg/L、20.00mg/L的尿素标准工作液，现配现用。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱仪：配有荧光检测器。 5.2pH计。 5.3分析天平：感量为0.1mg。 5.4涡旋混合器。 1 QB/T47102014 5.5带塞试管。 5.6微孔过滤膜：孔径0.45μm（有机系） 5.7移液管：1.0mL和2.0mL。 6分析步骤 6.1样品衍生 准确啄取2.0mL样品于1bmL容量瓶中，用无水乙醇 （4.4）定容至刻度，混匀；准确吸取0.40mL 稀释后的样品，置于带塞试管中，加入.10mL盐酸溶液 反（4.10）、0.60mL9-羟基占吨溶液（4.11）， 混匀。室避光衍生30min，经0.45um有机系滤膜过滤，滤液用于液相色谱测定。 6.2参考色谱条件 6.2.1色谱柱：C18i色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）或等效色谱椎。 6.2.2柱温35℃。 6.2.3检测波长：lex为213rm；Aem为308nm。 6.2.4 流速：1.0mL/min。 6.2.5 进样体积：1oμL。 梯度洗脱详兜表1。 6.2. 6 表1梯度洗脱程序表 时间/min 0.02mol/L乙酸钠/% 0.00 80 20 12.00 50 50 15.60 0 100 22.00 0 100 23.00 80 20 30.60 80 20 6.3定性分析 根据尿素标准品衍生物的保留时间，与待测样品中组分的保留时间进行定性，定性色谱图参见附录A。 6.4外标法定量 分别吸取0.40mL各浓度尿素标准工作液（4.14）和0.40mL样品溶液，依照6.1方法进行衍生， 以尿素标准工作液系列浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标绘制标准曲线。得到样品中尿素色谱峰面 积后，由标准曲线计算样品中的尿素含量。 6.5空电试验 除不称取样品外 均按上述步骤同时完成空白试验。 7结果计算 样品中尿素的含量按公式（1）计算： (1) 式中： 样品中尿素的含量，单位为毫克每升（mg/L） X 从标准曲线查得样品中尿素的含量，单位为毫克每升（mg/L)； 2 QB/T4710—2014 从标准曲线查得试剂空白中尿素的含量，单位为毫克每升（mg/L） C 样品稀释倍数。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。 8精密度 在重复性测定条件下获得的两次独应测定结果的绝对差值不应超过其算术平均值的10% QB/T47102014 附录A （资料性附录） 尿素标准品及样品中尿素衍生物色谱图 尿素衍生物 100.00 F00'08 00:09 40.00 20.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 t/min 图A.1尿素标准品衍生物色谱图 200.00 180.00 160.00 1.40.00 120.00 ≥ 100.00 尿素衍生物 80.00- 80.00- 40.00 20.00- 000 15.00 20.00 25.00 5.00 10.00 t/min 图A.2 2样品中尿素衍生物色谱图 4