SN-T 4291-2015 猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫检疫技术规范

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４２９１—２０１５猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊犻犿犻犪狀犻犿犿狌狀狅犱犲犳犻犮犻犲狀犮狔狏犻狉狌狊狑犻狋犺犱狅狋犻犿犿狌狀狅犫犻狀犱犻狀犵犪狊狊犪狔２０１５０９０２发布２０１６０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广西出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、苏州西山生物技术有限公司。本标准主要起草人：罗兆飞、温和心、陈立军、刘军义、盘宝进、罗广生、韦梅良、艾军、时长军、郭连香。 Ⅰ犛犖／犜４２９１—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法检疫技术规范１　范围本标准规定了实验猴猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶ）斑点酶免疫法实验室检测的操作程序和技术要求。本标准适用于实验猴猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶ）的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１实验猴　犾犪犫狆狉犻犿犪狋犲狊人工饲养，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的非人灵长类动物，如食蟹猴、猕猴等。３．２斑点酶免疫法　犲狀狕狔犿犲  犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狆狅狋犪狊狊犪狔将抗原吸附到硝酸纤维膜上，将吸附了待检血清的滤纸盖在抗原点上，样本中病毒抗体和膜上的抗原发生特异结合，然后加入酶标二抗反应，最后加入底物显色，使特异的抗原 抗体酶结合物点呈现肉眼可见的红色斑点，以定性检测病毒抗体。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＳＩＶ：猴免疫缺陷病毒（ｓｉｍｉａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ）５　设备和材料５．１　恒温培养箱或水浴箱：３７．０℃。５．２　跷跷板式摇床或酶标板摇床。５．３　涡旋振荡器。５．４　可调移液器及吸头。５．５　电子分析天平：精度０．１ｍｇ。５．６　载样条：宽０．５ｃｍ，长１ｃｍ的小滤纸条。１犛犖／犜４２９１—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．７　渗滤垫：大小为９ｃｍ×９ｃｍ的厚滤纸。５．８　尖头镊子。５．９　大小为９ｃｍ×９ｃｍ方形塑料平皿。６　试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。注：不同试剂盒制造商的产品应严格按照其说明书要求操作，本标准以猴免疫缺陷病毒斑点酶联免疫检测试剂盒（ＶＲＬ）１）盒中的试剂及配制为例。１）　由苏州西山生物技术有限公司提供的产品的商品名。给出这—信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果有其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。６．１　预点ＳＩＶ抗原的硝酸纤维抗原膜。６．２　０．１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４磷酸盐缓冲液母液（１０×ＰＢＳ）：称取８０ｇＮａＣｌ，２９ｇＮａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ，２ｇＫＣｌ，１．９ｇＫＨ２ＰＯ４，加水至１Ｌ，充分溶解。６．３　磷酸盐缓冲液（１×ＰＢＳ）：取１００ｍＬ１０×ＰＢＳ，加９００ｍＬ水，混匀。６．４　样本稀释液：称取５ｇ脱脂奶粉，加ＰＢＳ至１００ｍＬ。６．５　洗涤液（０．１％ＰＢＳＴ）：往１Ｌ１×ＰＢＳ中加１ｍＬ吐温 ２０，混匀。６．６　０．２ｍｏｌ／ＬｐＨ８．０Ｔｒｉｓ缓冲液：称取１１．３４ｇＴｒｉｓ粉末，加水至４００ｍＬ。６．７　显色剂Ａ：称取１５ｍｇ４ 氯 ２ 甲基重氮苯１，５ 萘二磺酸盐（耐晒红ＴＲ盐），加Ｔｒｉｓ缓冲液至５ｍＬ，充分溶解，即用即配。６．８　显色剂Ｂ：称取２ｍｇ茶酚，加水至５ｍＬ。６．９　酶标二抗：取１０μＬ碱性磷酸酶标记的羊抗猴ＩｇＧ抗体加入１０ｍＬＰＢＳ中作１∶１０００稀释作为工作液。６．１０　终止液（０．１％ＥＤＴＡ）：称取１ｇＥＤＴＡ，用去离子水稀释，定容至１０００ｍＬ，室温保存。６．１１　阳性对照血清。６．１２　阴性对照血清。７　检验方法７．１　样品处理采集静脉血１．５ｍＬ，分离血清备用。７．２　操作步骤７．２．１　血清稀释：用样本稀释液将样品和阴性、阳性血清作１∶５稀释，涡旋混匀。７．２．２　准备膜：取出抗原膜，编号后置于平皿中，加入１５ｍＬ样本稀释液，置摇床上慢速摇动，室温封闭３０ｍｉｎ，结束后将膜用１×ＰＢＳ快速洗涤三次，每次１ｍｉｎ，最后弃去洗液，然后在抗原膜下垫入一张渗滤垫，注入少许０．１％ＰＢＳＴ，确认膜和滤纸充分湿润，再倒出多余液体，直至膜上不挂液为止。７．２．３　贴膜：用尖头镊子轻夹一片载样条，将一端小心浸入样品稀释液中，待载样条吸附上液体后提出液面，并将纸条在试管口轻刷１次～２次，去掉多余的液体，然后贴覆在抗原膜上。用吸水纸擦干镊尖，再贴下一个样本。７．２．４　孵育：每张膜贴好后，盖上平皿盖，置于水浴箱或恒温培养箱中３７．０℃孵育３０ｍｉｎ。７．２．５　洗涤：用０．１％ＰＢＳＴ冲去膜上的载样条，并取走渗滤垫后加适量０．１％ＰＢＳＴ，置摇床上中速摇２犛犖／犜４２９１—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.动，洗涤三次，每次５ｍｉｎ，最后弃去洗液。７．２．６　酶标二抗反应：将稀释好的酶标二抗倒入平皿，于室温（２０℃～２８℃）孵育３０ｍｉｎ。７．２．７　洗涤：弃去二抗，用０．１％ＰＢＳＴ洗涤三次，每次５ｍｉｎ，洗涤过程中置摇床上中速摇动，最后弃去洗液。７．２．８　显色：先将配好的显色剂Ａ和显色剂Ｂ等体积混合，然后倒入平皿中，反应时轻摇平皿，待弱阳性对照清晰可见（相当于图１中“＋／－” ）时即可终止反应。约需２ｍｉｎ～５ｍｉｎ。７．２．９　终止：将染好的膜浸入预先准备的１５ｍＬ终止液中，１ｍｉｎ后用蒸馏水快速洗涤４次～５次，将膜置于空气中自然晾干。８　结果判定阳性对照呈肉眼可见的红色斑点，阴性对照无染色则实验成立。若待检样品病毒抗原点呈红色，如图１中“＋～＋＋＋”深度，则判为阳性，对于阳性结果，选用本方法或另一种方法重试，如仍为阳性者判为阳性；若待检样本病毒抗原点呈现较浅的红色，如图１中“＋／－”深度，则判为可疑；对于可疑的结果，选用本方法或另一种方法重试，如仍为可疑者判为阳性；若待检样品病毒抗原点无色，则判为阴性。图１９　生物安全要求开展该检测项目的实验室应满足ＧＢ１９４８９中生物安全二级实验室要求。犛犖／犜４２９１—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书５１０２—１９２４犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法检疫技术规范ＳＮ／Ｔ４２９１—２０１５ 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲２号（１０００２９）北京市西城区三里河北街１６号（１０００４５）总编室：（０１０）６８５３３５３３网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数８千字２０１６年４月第一版　２０１６年４月第一次印刷印数１—１１００ 书号：１５５０６６·２  ２９８７７　定价１６．００元 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.