SN-T 4288-2015 Optimum Intrasect中转基因成分定性PCR检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４２８８—２０１５犗狆狋犻犿狌犿犐狀狋狉犪狊犲犮狋中转基因成分定性犘犆犚　检测方法犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狀犵犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱犮狅狉狀犾犻狀犲犗狆狋犻犿狌犿犐狀狋狉犪狊犲犮狋２０１５０９０２发布２０１６０４０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：黄新、凌杏园、潘良文、张丽丽、朱水芳、陈洪俊、段胜男。 Ⅰ犛犖／犜４２８８—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.犗狆狋犻犿狌犿犐狀狋狉犪狊犲犮狋中转基因成分定性犘犆犚　检测方法１　范围本标准规定了转基因玉米ＯｐｔｉｍｕｍＩｎｔｒａｓｅｃｔ中转基因成分定性实时荧光ＰＣＲ检测方法。本标准适用于单粒玉米复合性状品系ＯｐｔｉｍｕｍＩｎｔｒａｓｅｃｔ（ＭＯＮ８１０×ＴＣ１５０７×ＮＫ６０３）的检测，但不适合玉米加工产品中该品系成分的检测。本标准中检测方法还适用于玉米及其产品中转基因单转化事件Ｂｔ１１、ＧＡ２１、ＭＯＮ８１０、ＭＯＮ８６３、ＭＯＮ８９０３４、ＴＣ１５０７、ＮＫ６０３、Ｔ２５、ＭＯＮ８８０１７、５９１２２、ＭＩＲ６０４、ＭＩＲ１６２、ＬＹ０３８、３２７２和ＭＯＮ８７４６０的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１９４９５．１ —２００４　转基因产品检测　通用要求和定义ＧＢ／Ｔ１９４９５．２　转基因产品检测　实验室技术要求ＧＢ／Ｔ１９４９５．３　转基因产品检测　核酸提取纯化方法ＧＢ／Ｔ１９４９５．７　转基因产品检测　抽样和制样方法３　术语、定义和缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１转基因复合性状品系　狊狋犪犮犽犲犱犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱狆犾犪狀狋狊是由两个和两个以上单转化事件（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｖｅｎｔ）通过杂交或单转化事件再转化形成的叠合了两个和两个以上性状的转基因新品系。３．１．２犗狆狋犻犿狌犿犐狀狋狉犪狊犲犮狋是由杜邦先锋公司研发的转基因玉米复合品系，由单转化事件ＭＯＮ８１０，ＴＣ１５０７，ＮＫ６０３通过常规杂交育成，叠合了源于品系ＭＯＮ８１０的抗虫性状和源于品系ＴＣ１５０７和ＮＫ６０３的耐除草剂草丁膦和草甘膦性状。已在美国、日本、加拿大、巴西和阿根廷等国家获得批准商业化。３．２　缩略语下列缩略语适用于本文件。犃犱犺１（ＡｌｃｏｈｏｌＤｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）：乙醇脱氢酶基因１犛犖／犜４２８８—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.ｂｐ（ｂａｓｅｐａｉｒ）：碱基对Ｃｔ值（Ｃ：Ｃｙｃｌｅ，ｔ：ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：每个反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）：十六烷基三甲基溴化铵ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：简称ＰＣＲ犜犪狇（犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌）：水生栖热菌ＴＥ：Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ＥＤＴＡ缓冲液ＴＭ（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：熔解温度Ｔｒｉｓ［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］：三（羟甲基）氨基甲烷ＵＮＧ酶（ｕｒａｃｉｌ  Ｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）：尿嘧啶 Ｎ 糖基化酶（ＵＮＧ）酶犣犲犻狀：玉米醇溶蛋白基因４　方法提要ＰＣＲ反应过程中，荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成呈正相关，根据荧光信号的强度和扩增曲线Ｃｔ值判定样品中是否含有特定的转基因玉米转化事件。由于现阶段已知转基因玉米复合品系均由已知的单转化事件玉米杂交而成。在复合性状品系中，这些单转化事件的边界序列未发生改变，因此，通过对单粒玉米不同单转化事件玉米的检测，就可以判断该种子是由哪些单转化事件叠合而成。５　主要仪器及试剂５．１　主要仪器实时荧光ＰＣＲ仪；冷冻研磨仪；消毒灭菌锅；制冰机；核酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机，台式小型离心机，Ｍｉｎｉ个人离心机；低温冰箱；旋涡震荡器；微量移液器，生物安全柜。５．２　主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。玉米内源基因和各单转化事件检测用边界序列的引物和探针序列见附录Ａ。主要试剂参见附录Ｂ。６　防止污染措施防止污染措施按ＧＢ／Ｔ１９４９５．２的规定实施。７　抽样与制样７．１　抽样按照ＧＢ／Ｔ１９４９５．７中的规定获得实验室样品。７．２　制样复合性状品系检测按单粒玉米种子检测，先用清洁剂彻底清洗种子表面，再用核酸酶彻底降解种子表面污染ＤＮＡ，最后用无菌水冲洗后晾干。用剪刀将每粒种子对中剪开，一分为二，取半粒玉米种子，２犛犖／犜４２８８—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.用液氮或冷冻研磨仪将其粉碎至细粉状。留存另外半粒玉米以备进一步验证。８　犇犖犃提取及浓度测定８．１　犇犖犃提取８．１．１　犆犜犃犅方法按照ＧＢ／Ｔ１９４９５．３ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ中的ＣＴＡＢ  ２法。或按以下步骤提取ＤＮＡ：ａ）　将待测样品磨碎，迅速转入２ｍＬ离心管中，加６５℃预热的ＣＴＡＢ提取液（Ｂ．６）７００μＬ，２μＬ蛋白酶Ｋ（Ｂ．１１），混匀，６５℃水浴３０ｍｉｎ。ｂ）加５μＬＲＮａｓｅＡ（Ｂ．５），３７℃水浴３０ｍｉｎ。ｃ）加入等体积Ｔｒｉｓ饱和酚，充分混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。ｄ）取上清，加入等体积的三氯甲烷／异戊醇（２４∶１）（Ｂ．８）混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。ｅ）取上清，加入等体积的三氯甲烷／异戊醇（２４∶１）混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。ｆ）取上清，加入７０％体积预冷的异丙醇（Ｂ．９），轻轻摇晃，置于－２０℃冰箱静置３０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。ｇ）弃上清，保留沉淀，加入７０％乙醇（Ｂ．１０）５００μＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，去上清，重复２次。ｈ）得到ＤＮＡ沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入５０μＬ～１００μＬＴＥ（Ｂ．７）或无菌去离子水，充分溶解后，测定ＤＮＡ的纯度和浓度，后置于－２０℃冰箱中保存。８．１．２　试剂盒法不同基因组ＤＮＡ提取试剂盒，使用时按操作说明书操作。８．２　犇犖犃浓度测定样品ＤＮＡ用紫外分光光度计测定２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：ＤＮＡ纯度以ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值表示