书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ２ ８ ３．２—２ ０ １ ５ 国境口岸微孔板基因芯片检测方法第２部分：结核分枝杆菌及 犽 犪 狋 犌和狉狆狅 犅耐药变异基因 犜 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳犿 犻 犮 狉 狅 狆犾 犪 狋 犲犵犲 狀 犲犮 犺 犻狆犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉 狆狅 狉 狋—犘 犪 狉 狋２：犕狔犮 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 狌 犿狋 狌 犫 犲 狉 犮 狌 犾 狅 狊 犻 狊犪 狀 犱犱 狉 狌 犵狉 犲 狊 犻 狊 狋 犪 狀 狋犿 狌 狋 犪 狋 犻 狅 狀 狊狅 犳犽 犪 狋 犌犪 狀 犱狉 狆狅 犅犵犲 狀 犲 狊 ２ ０ １ ５０ ５２ ６发布 ２ ０ １ ６０ １０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３《国境口岸微孔板基因芯片检测方法 》为系列标准 ，分为六个部分 ： — — —第１部分：通用技术规程 ； — — —第２部分：结核分枝杆菌及 ｋ ａ ｔ Ｇ和ｒｐｏ Ｂ耐药变异基因 ； — — —第３部分：７种呼吸道病毒 ； — — —第４部分：肠道病毒及肠道病毒 ７ １型、柯萨奇病毒 Ａ １ ６型； — — —第５部分：肺炎支原体 、肺炎衣原体及嗜肺军团菌 ； — — —第６部分：１ ２种食源性致病菌 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３的第２部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、深圳市检验检疫科学研究院 、深圳市南山区慢性病防治院 、珠海精标仪器有限公司 。本部分主要起草人 ：刘春晓、杨燕秋、张涛、张树平、刘君、顾大勇、史蕾、赵纯中、何建安、徐云庆、李永进。 Ⅰ犛 犖／犜４ ２ ８ ３．２—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.国境口岸微孔板基因芯片检测方法第２部分：结核分枝杆菌及 犽 犪 狋 犌和狉狆狅 犅耐药变异基因 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３的本部分规定了国境口岸结核分枝杆菌及 ｋ ａ ｔ Ｇ和ｒｐｏ Ｂ耐药变异基因的微孔板基因芯片检测方法 。本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对结核分枝杆菌及 ｋ ａ ｔ Ｇ和ｒｐｏ Ｂ两个耐药变异基因进行检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室　生物安全通用要求 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ２ ６ ２　国境口岸结核病检验规程 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ７ ５ ２． ４ —２ ０ １ １　卫生检疫人员的自我防护规范 　第４部分：实验室人员 Ｓ Ｎ／Ｔ３ ３ １ ２　结核分枝杆菌 γ干扰素体外检测方法 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３． １ 　国境口岸微孔板芯片检测方法 　第１部分：通用技术规程 ＷＳ２ ３ ３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 ３　术语和定义 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３． １ 和Ｓ Ｎ／Ｔ１ ２ ６ ２、Ｓ Ｎ／Ｔ３ ３ １ ２界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。 ３．１耐药变异基因 　犱 狉 狌犵狉 犲 狊 犻 狊 狋 犪 狀 狋犿 狌 狋 犪 狋 犻 狅 狀 狊由于发生碱基的插入 、缺失、置换等而导致耐药产生的基因 。耐药基因变异是结核分枝杆菌产生耐药性的主要机制 。 ３．２犽 犪 狋 犌基因　犽 犪 狋 犌犵犲 狀 犲过氧化氢酶 过氧化物酶 （ｃ ａ ｔ ａ ｌ ａ ｓ ｅ  ｐｅ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｓ ｅ ）的编码基因 。 ３．３狉狆狅 犅基因　狉狆狅 犅犵犲 狀 犲结核杆菌 ＤＮＡ依赖ＲＮＡ聚合酶（ＤＮＡ  ｄ ｅｐｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔＲＮＡ ｐｏ ｌｙｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ，Ｄ Ｐ Ｒ Ｐ）β亚单位的编码基因。 ４　缩略语 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３． １ 界定的以及下列缩略语适用于本文件 。 １犛 犖／犜４ ２ ８ ３．２—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.Ｋ ａ ｔ Ｇ：过氧化氢酶 过氧化物酶 （ｃ ａ ｔ ａ ｌ ａ ｓ ｅ  ｐｅ ｒ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｓ ｅ ） ｒｐｏ Ｂ：ＲＮＡ聚合酶β亚单位（ＲＮＡｐｏ ｌｙｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅｂ ｅ ｔ ａ  ｓ ｕ ｂ ｕ ｎ ｉ ｔ ） ＭＴ Ｂ：结核分枝杆菌 （ｍｙｃ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍｔ ｕ ｂ ｅ ｒ ｃ ｕ ｌ ｏ ｓ ｉ ｓ ） ＷＴ：野生型（ｗ ｉ ｌ ｄｔｙ ｐｅ） ５　生物安全防护要求 ５．１　实验室应遵循 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 和ＷＳ２ ３ ３ 对应的生物安全要求 。 ５．２　实验人员的防护遵循 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ７ ５ ２． ４ —２ ０ １ １的要求。 ６　主要设备和试剂 ６．１　主要设备 ：基因芯片点样仪 、芯片杂交仪 、芯片清洗显色仪 、生物芯片全自动扫描判读仪 、Ｐ Ｃ Ｒ仪、 生物安全柜 、离心机、移液器、恒温水浴锅等 。 ６．２　主要试剂 ：结核分枝杆菌及 ｋ ａ ｔ Ｇ和ｒｐｏ Ｂ耐药变异基因微孔板芯片检测试剂盒或自行设置结核分 枝杆菌及 ｋ ａ ｔ Ｇ和ｒｐｏ Ｂ耐药变异基因微孔板芯片检测试剂 （相关引物及探针序列参见附录 Ａ） 。 ７　检测流程 ７．１　样品核酸的提取 ７．１．１　痰液等标品 ＤＮＡ的提取如下 ：吸取痰液干酪样或脓性黏液部分 （或胸水、肺泡灌洗液 、浑浊的脑 脊液离心后取沉淀物 ）２ｍＬ于无菌尖底离心管内 ，加入等量临用前新鲜配制的消化液 （４％ Ｎ ａ ＯＨ ５ ０ｍＬ＋２． ９ ４％ 柠檬酸钠 ５ ０ｍＬ＋ 犖乙酰犔半胱氨酸 ０． ５ｇ，充分溶解混匀 ） ，置涡旋混均器上混匀 １ ５ｓ～２ ０ｓ，室温静置 １ ５ｍ ｉ ｎ，使之充分液化至清亮 。加入无菌 ｐＨ６． ８Ｐ Ｂ Ｓ 缓冲液至 ２ ０ｍＬ，混匀， ３０ ０ ０犵离心１ ５ｍ ｉ ｎ，弃去上清液 。于沉淀中提取样品 ＤＮＡ，可参照Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３． １ 。 ７．１．２　培养的菌落样品 ＤＮＡ可直接提取 ，参照Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３． １ 。 ７．２　犘 犆 犚扩增反应 ７．２．１　可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置 Ｐ Ｃ Ｒ反应体系 ，或自行配置 ２ ５μＬＰ Ｃ Ｒ反应体系 ： １ ０×Ｐ Ｃ Ｒ 缓冲液２． ５μＬ，ｄ ＮＴ Ｐ ｓ（各５μｍ ｏ ｌ／Ｌ）２μＬ，ＭｇＣ ｌ２（２ ５ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ）２μＬ，所有上下游引物 （含 Ｐ Ｃ Ｒ阳性对照 ） （各５μｍ ｏ ｌ／Ｌ）混合液２μＬ，犜 犪狇ＤＮＡ聚合酶０． ２ ５μＬ，模板核酸 ５μＬ（含阳性对照核酸 １μＬ，主要为细菌基因组 ＤＮＡ） ，ｄ ｄ Ｈ ２Ｏ１ １． ２ ５ μＬ；振荡混匀 ，并轻微离心 。 ７．２．２　将上述Ｐ Ｃ Ｒ反应管放入 Ｐ Ｃ Ｒ仪，设定Ｐ Ｃ Ｒ反应程序 ：首先９ ５℃变性５ｍ ｉ ｎ；然后９ ５℃变性 ３ ０ｓ，５ ５℃退火３ ０ｓ，７ ２℃延伸３ ０ｓ，３ ５个循环；最后７ ２℃延伸７ｍ ｉ ｎ，４℃保存备用 ；若需长期使用请 置于－２ ０℃保存。 ７．３　微孔板基因芯片杂交反应 ７．３．１　开启芯片杂交仪 ，并设置芯片杂交仪预加热至 ５ ０℃。 ７．３．２　按试验要求准备所需的微孔板基因芯片 ，并准确、清晰标记 。将杂交反应液平衡至室温 ，轻轻摇 动混合均匀后 ，分别取１ ０ ０μＬ加入微孔板各检测孔中 ；在桌面轻轻平行晃动微孔板 ，使各孔中的杂交反 应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生 ，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除 。 ２犛 犖／犜４ ２ ８ ３．２—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.７．３．３　取样品Ｐ Ｃ Ｒ产物１ ０μＬ于Ｐ Ｃ Ｒ仪中９ ５℃加热５ｍ ｉ ｎ，待Ｐ Ｃ Ｒ仪降温至 ４℃后取出并立即置于 冰上备用 。 ７．３．４　取上述已变性处理的 Ｐ Ｃ Ｒ产物１ ０μＬ加入芯片的对应检测孔中 ，贴上杂交反应盘胶膜 ，置于芯 片杂交仪中 ４ ５℃，振荡反应 １ｈ。 ７．４　微孔板基因芯片显色反应 ７．４．１　杂交反应结束后 ，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空 ，每孔加入洗涤液 ２ ０ ０μＬ，在桌 面轻轻平行晃动微孔板 ２ ０ｓ（以反应孔内液体不溢出为限 ） ，然后用力甩干反应孔中液体 ，重复上述动作 ２遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次 ，以去除残留液体 。 ７．４．２　于各反应孔中加入 １ ０ ０μＬ显色检测液 ，室温静置反应 ２ ０ｍ ｉ ｎ后，用力甩于反应孔中液体 。然后 加入２ ０ ０μＬ洗涤液，静置１ｍ ｉ ｎ，甩干孔中液体 ，重复上述动作 ２遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于 擦手纸上轻拍数次 ，以去除残留液体 。 ７．４．３　于各反应孔中加入 １ ０ ０μＬ显色液，室温避光反应 ８ｍ ｉ ｎ后，用力甩干孔中液体 。ｄ ｄ Ｈ ２Ｏ冲洗芯 片内部，于擦手纸上轻拍数次 ，以去除残留之液体 ，置于５ ０℃烘箱或室温干燥 。 注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序 ，按照操作说明