书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ２ ８ ３．１—２ ０ １ ５ 国境口岸微孔板基因芯片检测方法第１部分：通用技术规程 犜 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳犿 犻 犮 狉 狅 狆犾 犪 狋 犲犵犲 狀 犲犮 犺 犻狆犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉 狆狅 狉 狋—犘 犪 狉 狋１：犌 犲 狀 犲 狉 犪 犾 狋 犲 犮 犺 狀 犻 犮 犪 犾 狆狉 狅 犮 犲 犱 狌 狉 犲 ２ ０ １ ５０ ５２ ６发布 ２ ０ １ ６０ １０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第１部分：通用技术规程 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３． １ —２ ０ １ ５ 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲 ２号（１ ０ ０ ０ ２ ９） 北京市西城区三里河北街 １ ６号（１ ０ ０ ０ ４ ５） 总编室： （０ １ ０）６ ８ ５ ３ ３ ５ ３ ３ 网址ｗｗｗ． ｓｐｃ ． ｎ ｅ ｔ ． ｃ ｎ中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本８ ８ ０×１ ２ ３ ０ １ ／１ ６　印张０． ７ ５　字数１ ８千字 ２ ０ １ ６年２月第一版 　２ ０ １ ６年２月第一次印刷 印数１—１１ ０ ０ 书号：１ ５ ５ ０ ６ ６·２  ２ ９ ６ ０ ６ 　定价１ ６．０ ０元 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３《国境口岸微孔板基因芯片检测方法 》为系列标准 ，分为六个部分 ： — — —第１部分：通用技术规程 ； — — —第２部分：结核分枝杆菌及 ｋ ａ ｔ Ｇ和ｒｐｏ Ｂ耐药变异基因 ； — — —第３部分：７种呼吸道病毒 ； — — —第４部分：肠道病毒及肠道病毒 ７ １型、柯萨奇病毒 Ａ １ ６型； — — —第５部分：肺炎支原体 、肺炎衣原体及嗜肺军团菌 ； — — —第６部分：１ ２种食源性致病菌 。本部分为 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３的第１部分。本部分按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本部分起草单位 ：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、深圳市检验检疫科学研究院 、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局 、中华人民共和国四川出入境检验检疫局 、中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局 、中华人民共和国河南出入境检验检疫局 、中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、清华大学深圳研究生院 、深圳市南山区慢性病防治院 、珠海精标仪器有限公司 、深圳图普科技有限公司 。本部分主要起草人 ：顾大勇、辛本强、董瑞玲、廖凌、樊学军、高国龙、刘芳、赵芳、刘春晓、杨燕秋、张树平、史蕾、赵纯中、何建安、刘君、徐媛、林勤丰、徐云庆、张勤、黄恩炯、马岚、张涛、李永进、倪秀。 Ⅰ犛 犖／犜４ ２ ８ ３．１—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.国境口岸微孔板基因芯片检测方法第１部分：通用技术规程 １　范围 Ｓ Ｎ／Ｔ４ ２ ８ ３的本部分规定了微孔板基因芯片检测方法的通用技术规程 ，包括微孔板基因芯片的制备、检测流程 、结果报告及阳性结果的处置等部分 。本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术进行检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室　生物安全通用要求 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ７ ５ ２． ４ —２ ０ １ １　卫生检疫人员的自我防护规范 　第４部分：实验室人员 ＷＳ２ ３ ３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３．１微孔板基因芯片 　犿 犻 犮 狉 狅狆犾 犪 狋 犲犵犲 狀 犲犮 犺 犻狆与传统的基于玻片或膜的平面式基因芯片不同 ，其将基因探针按预设模式固定在微孔内 ，每孔即为一张芯片 。本部分涉及的微孔板基因芯片技术具有如下特点 ： （ａ）芯片的载体为高分子材质的微孔板 ，类似于８×１ ２的Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ反应板，每孔即为一张芯片 。可以整板使用有最多 ９ ６个反应孔 ，也可以根据实际需要拆装所需的反应孔数 ，具有微量 、高通量的特点 。（ｂ）芯片反应孔面无需有机薄膜涂层修饰或化学生物等的修饰 ，可直接将基因探针点样到孔面上 ，在紫外作用下通过氢键结合 ，使包被的探针不易脱落，具有芯片制备操作简单方便的特点 。（ｃ）芯片检测采用化学显色反应的检测方式 ，其检测原理为生物素化的 Ｐ Ｃ Ｒ产物与芯片杂交 ，经由链霉亲和素 碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视也可借助芯片扫描仪进行定量分析 ，具有快速简便可视的特点 。 ３．２特异性探针 　狊狆犲 犮 犻 犳 犻 犮狆狉 狅 犫 犲能与样品中的特异性目标核酸杂交 ，实现检测目的的一段寡核苷酸分子片段 。 ３．３阳性对照探针 　狆狅 狊 犻 狋 犻 狏 犲犮 狅 狀 狋 狉 狅 犾 狆狉 狅 犫 犲能与预设的特定目标核酸杂交 ，但与检测目标核酸无交叉杂交反应的一段寡核苷酸分子片段 ，可以用于实现对全部或部分检测流程进行质量控制 。本部分涉及 Ｐ Ｃ Ｒ阳性对照探针和杂交阳性对照探针 。 ３．４阴性对照探针 　狀 犲犵犪 狋 犻 狏 犲犮 狅 狀 狋 狉 狅 犾 狆狉 狅 犫 犲即空白对照探针 ，可以是一段人工设计合成的没有配对杂交对象的或是与本试验无关的寡核苷酸 １犛 犖／犜４ ２ ８ ３．１—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.片段，甚至也可以是不含任何特意添加的核酸片段 ，主要用于监控基因芯片的杂交背景 。 ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 Ｂ Ｓ Ａ：牛血清白蛋白 （ｂ ｏ ｖ ｉ ｎ ｅｓ ｅ ｒ ｕ ｍａ ｌ ｂ ｕ ｍ ｉ ｎ ） ｄ ＮＴ Ｐ：脱氧核苷酸三磷酸 （ｄ ｅ ｏ ｘｙｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｄ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ） Ｐ Ｃ Ｒ：聚合酶链式反应 （ｐｏ ｌｙｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅｃ ｈ ａ ｉ ｎｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ） ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ ：逆转录Ｐ Ｃ Ｒ（ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐｔ ｉ ｏ ｎ ｐｏ ｌｙｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅｃ ｈ ａ ｉ ｎｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ） Ｓ Ｄ Ｓ：十二烷基磺酸钠 （ｓ ｏ ｄ ｉ ｕ ｍｄ ｏ ｄ ｅ ｃ ｙｌｓ ｕ ｌ ｆ ｏ ｎ ａ ｔ ｅ ） ＵＶ：紫外线（ｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｖ ｉ ｏ ｌ ｅ ｔ ） ５　生物安全防护要求 ５．１　实验室应遵循 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 和ＷＳ２ ３ ３ 对应的生物安全要求 。 ５．２　实验人员的防护遵循 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ７ ５ ２． ４ —２ ０ １ １的要求。 ６　主要设备和试剂 ６．１　主要设备 ：基因芯片点样仪 、芯片杂交仪 、芯片清洗显色仪 、生物芯片全自动扫描判读仪 、ＵＶ交联仪、Ｐ Ｃ Ｒ仪、生物定全柜 、离心机、移液器、恒温水浴锅等 。 ６．２　主要试剂 ：微孔板基因芯片检测试剂盒或微孔板 （聚苯乙烯材质 ） 、引物（５ ′端生物素修饰 ） 、探针 ［５ ′端２ ０个ｐｏ ｌｙ（Ｔ）修饰］ 、１×Ｔ Ｅ缓冲液（ｐＨ８． ０） （参见附录 Ａ中Ａ． １） 、探针缓冲液 （参见Ａ． ２） 、漂洗缓冲液（参见Ａ． ３） 、核酸提取试剂 、Ｐ Ｃ Ｒ和ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 反应试剂 、杂交反应液 （参见Ａ． ４） 、洗涤液（参见 Ａ． ５） 、显色检测液 （参见Ａ． ６） 、显色液（参见Ａ． ７） 。 ７　微孔板基因芯片的制备 ７．１　如有合适的微孔板基因芯片检测试剂盒或适用的已固化好探针的微孔板基因芯片 ，则可以直接进入检测流程 ，即第８章。 ７．２　如没有合适的微孔板基因芯片检测试剂盒或适用的已固化好探针的微孔板基因芯片 ，需自行固化探针制备微孔板基因芯片 ，则按以下步骤进行 ： ａ）　取整板的空白微孔板或者是按试验要求拆装所需的反应孔板 ，去离子水逐个清洗微孔 ，再用 ｄ ｄ Ｈ ２Ｏ反复冲洗 ５次后，干燥备用 。 ｂ）分别用１×Ｔ Ｅ缓冲液（ｐＨ８． ０）溶解合成的各特异性探针以及 Ｐ Ｃ Ｒ阳性对照探针 、杂交阳性对照探针 、阴性对照探针至 １ ０ ０μｍ ｏ ｌ／Ｌ，然后分别取探针溶液 ２ ５ ０μＬ，１ ０ ０μｍ ｏ ｌ／Ｌ探针缓冲液７ ５μＬ，ｄ ｄ Ｈ ２Ｏ１ ７ ５μＬ，混合均匀成 ５ ０ ０μＬ的１ ５μｍ ｏ ｌ／Ｌ探针点样溶液待用 。 ｃ）使用基因芯片点样仪 ，按设备操作说明书进行 ，分别将特异性探针 、阳性对照探针 、显色阳性对照探针、阴性对照探针按预先设置的位点模式点在微孔板微孔中相应的位置 。探针固定位点设置模式可参考 Ｂ． １。 ｄ）点好探针的微孔板芯片置于紫外交联仪中设置 ＵＶ  Ａ，照射０． ８Ｊ，共价交联固定探针 。 ｅ）ＵＶ交联后用漂洗缓冲液漂洗 ２次，ｄ ｄ Ｈ ２Ｏ冲洗２次，晾干；可立即使用 ，也可密闭包