SN-T 4280.1-2015 国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４２８０．１—２０１５国境口岸红头丽蝇犇犖犃条形码鉴定方法犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犪犾犾犻狆犺狅狉犪狏犻犮犻狀犪犚狅犫犻狀犲犪狌  犇犲狊狏狅犻犱狔，１８３０犪狋狋犺犲犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１５０５２６发布２０１６０１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本部分主要起草人：邱德义、岳巧云、张宪臣、刘德星、聂维忠、陈健、魏晓雅、吴可量、胡佳。 Ⅰ犛犖／犜４２８０．１—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸红头丽蝇犇犖犃条形码鉴定方法１　范围ＳＮ／Ｔ４２８０的本部分规定了红头丽蝇的ＤＮＡ条形码鉴定程序和结果判定。本部分适用于对红头丽蝇的成虫（包括肢体不全的成虫），以及蛹、幼虫、卵等ＤＮＡ条形码鉴定的工作。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１８７６　医学媒介生物标本采集、制作及保存规程ＳＮ／Ｔ２７５２．４　卫生检疫人员的自我防护规范　第４部分：实验室人员ＷＳ／Ｔ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１红头丽蝇　犆犪犾犾犻狆犺狅狉犪狏犻犮犻狀犪犚狅犫犻狀犲犪狌  犇犲狊狏狅犻犱狔，１８３０丽蝇科，丽蝇属。因为腹部呈青色，俗名为“ｂｌｕｅｂｌｏｗｆｌｙ”或者“ｂｌｕｅｂｏｔｔｌｅ ” ，因其颊部橙红色，所以中文名为红头丽蝇，为重要的媒介生物和法医昆虫。３．２犇犖犃条形码　犇犖犃犫犪狉犮狅犱犲生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的ＤＮＡ片段。ＤＮＡ条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在节肢动物尤其是昆虫中，一般是指线粒体ＣＯＩ（线粒体细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｉ）上的６５８ｂｐ的标准片段。３．３犇犖犃条形码鉴定技术　犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔一种利用ＤＮＡ条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、性别及形态特征完整与否的限制、减少对形态分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。３．４空白对照　犫犾犪狀犽犮狅狀狋狉狅犾从基因组ＤＮＡ提取步骤开始至ＰＣＲ扩增和ＰＣＲ产物检测整个过程，没有加入任何医学媒介昆虫组织的空白，与其他受试的昆虫平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照应没有ＰＣＲ产物条带产生。１犛犖／犜４２８０．１—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.３．５阳性对照　狆狅狊犻狋犻狏犲犮狅狀狋狉狅犾在ＰＣＲ扩增过程中，与受试样品平行进行的，在正常反应情况下，一定能产生ＰＣＲ产物的ＤＮＡ为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有ＰＣＲ产物带产生。３．６阴性对照　狀犲犵犪狋犻狏犲犮狅狀狋狉狅犾在ＰＣＲ扩增过程中，与受试样品平行进行的，用ｄｄＨ２Ｏ代替模板ＤＮＡ而进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否正常，确认没有受到污染，阴性对照应没有ＰＣＲ产物条带产生。３．７凭证标本　狏狅狌犮犺犲狉狊狆犲犮犻犿犲狀获取ＤＮＡ条形码等分子数据的来源（母体）标本。凭证标本可以是不完整的标本，但与本标本的ＤＮＡ条形码数据等分子凭证必须是一一对应的关系。凭证标本的保存非常重要，必须有唯一性标识如：标本编号、存放、鉴定以及采集等详细信息。３．８分子凭证　犿狅犾犲犮狌犾犪狉狏狅狌犮犺犲狉与凭证标本相对应的基因组ＤＮＡ、ＰＣＲ产物、ＤＮＡ条形码序列及峰图，做克隆还应包括含ＤＮＡ条形码片段的阳性转化子。分子凭证的保存非常重要，必须有唯一性的编号、存放等详细信息，以便于日后查证。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＯＬＤ：生物条形码数据系统（ｂａｒｃｏｄｉｎｇｏｆｌｉｆｅｄａｔａｓｙｓｔｅｍ）注：网址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｏｌｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｏｒｇ。５　原理利用线粒体ＤＮＡ中的ＣＯＩ基因的通用引物对受试样品基因组ＤＮＡ进行扩增，ＰＣＲ产物测序后，得到长度约为６５８ｂｐ（不包含引物的序列）的ＤＮＡ片段，跟ＢＯＬＤ数据库进行比对，根据序列的相似度实现物种鉴定的目的。６　引物ＬＣＯ１４９０　５’ ＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＧ  ３ ’ ＨＣＯ２１９８　５’ ＴＡＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡ  ３ ’ ７　鉴定程序７．１　准备实验室需具备的设备和试剂参见附录Ａ，实验室生物安全应符合ＧＢ１９４８９要求，人员防护应符合ＳＮ／Ｔ２７５２．４的规定；ＰＣＲ防污染措施遵照ＷＳ／Ｔ２３０执行。２犛犖／犜４２８０．１—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.７．２　标本的处理７．２．１　取样对所检测的标本进行唯一性标识。新鲜标本（包括卵、幼虫、蛹及成虫）及时冷冻或者置于毒瓶处死后，投入大于７５％的乙醇固定；截获的干燥标本和死标本直接投入大于７５％的乙醇固定。取样时，尽量减小组织块的大小，尽可能保持凭证标本的形态完整性，尤其是避免破坏具有重要分类意义的形态特征。７．２．２　凭证标本的制作将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照ＳＮ／Ｔ１８７６执行。７．３　基因组犇犖犃的抽提７．３．１　取样取成虫左侧前足或中足，若左侧前、中足缺失，可取右侧；或一个蛹、一头幼虫的一部分、一只卵，置于灭菌的洁净１．５ｍＬ离心管中，加入５０μＬ裂解液研磨至糜状，根据实验室实际情况，选择试剂盒法或者酚三氯甲烷法抽提ＤＮＡ。提取时应设置空白对照。７．３．２　试剂盒法按动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒的操作指导书进行基因组ＤＮＡ的抽提。７．３．３　酚三氯甲烷法细胞裂解后离心分离含核酸的水相，然后再加入等体积三氯甲烷 ∶异戊醇（２４∶１），１４０００犵离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，取上清液至一新的离心管中；加入等体积的饱和酚，１４０００犵离心５ｍｉｎ，转移上清液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚／三氯甲烷／异戊醇（２５∶２４∶１），１４０００犵离心５ｍｉｎ，转移上清液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚，１４０００犵离心５ｍｉｎ，转移上清液至一新的离心管；加入２倍体积的无水乙醇，１４０００犵离心５ｍｉｎ，弃上清液；加入５００μＬ的７０％乙醇，１４０００犵离心１ｍｉｎ，弃上清液，重复该步骤一次；室温或者３７℃彻底干燥离心管，加入５０μＬ经高压灭菌的ｄｄＨ２Ｏ溶解ＤＮＡ；提取的ＤＮＡ保存在４℃备用，长期保存应置于－２０℃或以下冷冻保存。７．４　犘犆犚扩增７．４．１　犘犆犚扩增体系根据实际情况，可以选择５０μＬ体系，或者２５μＬ体系。为了验证ＰＣＲ体系有无污染，需同时设置阴性对照。为了验证ＰＣＲ反应正常，需要设置阳性对照。５０μＬ体系：缓冲液（１０×）５μＬ，ｄＮＴＰ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，正反引物（２０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，模板５０ｎｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬ３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ３７．５μＬ。２５μＬ体系各组分减半。７．４．２　犘犆犚扩增条件９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ；１