SN-T 4278-2015 国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４２７８—２０１５国境口岸医学媒介昆虫犇犖犃条形码鉴定操作规程犘狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊狅犳犿犲犱犻犮犪犾犻狀狊犲犮狋犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１５０５２６发布２０１６０１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准国境口岸医学媒介昆虫犇犖犃条形码鉴定操作规程ＳＮ／Ｔ４２７８—２０１５ 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲２号（１０００２９）北京市西城区三里河北街１６号（１０００４５）总编室：（０１０）６８５３３５３３网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本８８０×１２３０１／１６　印张１．２５　字数３４千字２０１６年２月第一版　２０１６年２月第一次印刷印数１—１１００ 书号：１５５０６６·２  ２９５７２　定价２４．００元 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：岳巧云、邱德义、聂维忠、李云松、陈健、刘德星、魏晓雅、吴可量、胡佳。 Ⅰ犛犖／犜４２７８—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.引　　言ＤＮＡ条形码技术是近年来发展起来的一种建立在基因扩增和序列比对基础之上新的物种鉴定技术，利用生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的ＤＮＡ片段进行物种鉴定。该技术不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制，具有快速、准确、低成本等特点。２００３年，加拿大学者ＰａｕｌＨｅｂｅｒｔ等发现线粒体细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｉ（ＣＯＩ）基因片段能够提供一种快速、简便与可信的分类方法，可以准确地区分物种，并首次提出ＤＮＡ条码（ＤＮＡＢａｒｃｏｄｉｎｇ）的概念。２０１０年，由２６个国家合作成立了国际生命条码联盟（ｉＢＯＬ），致力于将ＤＮＡ条形码技术发展成为通用的一种高效、准确的物种鉴定方式，目前全球已经有超过５０个国家参加此联盟，目的是构建全球物种分子鉴定平台。ＢＯＬＤ生物条形码数据系统（Ｂａｒｃｏｄｉｎｇｏｆｌｉｆｅｄａｔａｓｙｓｔｅｍ）作为国际条形码组织的专用数据库及鉴定平台，对ＤＮＡ条形码及凭证标本的筛选有着严格的要求，如：必须有唯一性标本编号、存放、鉴定以及采集（采集人、带ＧＰＳ定位信息的采集地点的经纬度）等详细信息，要求基因片段必须大于５００ｂｐ、提供所使用的ＰＣＲ引物序列、测序图谱、原始序列等追踪档案。目前ＢＯＬＤ系统中已经包含超过２０万种生物的ＤＮＡ条形码序列，而且正以很快的速度增长。对于涉及国境口岸卫生安全的医学媒介昆虫鉴定而言，一般利用长度约为６５８ｂｐ的ＣＯＩ基因作为标准的ＤＮＡ条形码序列，跟ＢＯＬＤ、ＮＣＢＩ系统等数据库进行比对。本标准主要起草人多年来一直从事ＤＮＡ条形码鉴定工作，实验室近年已原始积累了３００多种媒介昆虫的ＤＮＡ条形码数据５０００余条，具有丰富的利用ＤＮＡ条形码技术进行物种鉴定的经验。本标准根据国际生命条码联盟（ｉＢＯＬ）对ＤＮＡ条形码的规定，结合国境口岸媒介监测工作的特点而制定，以推动和规范全国各地检验检疫机构利用ＤＮＡ条形码技术鉴定医学媒介昆虫的实验室操作，从而达到获得准确可靠结果的目的。 Ⅱ犛犖／犜４２７８—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸医学媒介昆虫犇犖犃条形码鉴定操作规程１　范围本标准规定了医学媒介昆虫ＤＮＡ条形码鉴定中的标本处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。本标准适用于检验检疫机构在国境口岸利用ＤＮＡ条形码技术对成虫（包括肢体残缺不全的成虫）以及蛹、幼虫和卵等依靠形态无法直接鉴定的医学媒介昆虫的种类鉴定工作。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１８７６　医学媒介生物标本采集、制作及保存规程ＳＮ／Ｔ２７５２．４　卫生检疫人员的自我防护规范　第４部分：实验室人员ＷＳ／Ｔ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１犇犖犃条形码　犇犖犃犫犪狉犮狅犱犲生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的ＤＮＡ片段。ＤＮＡ条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在医学媒介昆虫中，一般是指线粒体ＣＯＩ（线粒体细胞色素Ｃ氧化酶亚基Ｉ）上的６５８ｂｐ的标准片段。３．２犇犖犃条形码鉴定技术　犇犖犃犫犪狉犮狅犱犻狀犵犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狋犲犮犺狀犻狇狌犲一种利用ＤＮＡ条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。３．３凭证标本　狏狅狌犮犺犲狉狊狆犲犮犻犿犲狀获取ＤＮＡ条形码等分子数据的来源（母体）标本。凭证标本可以是形态不完整的标本，但与本标本的ＤＮＡ条形码数据等分子凭证必须是一一对应的关系。对于体型特别小的标本（如螨等），可以是同一批同种标本中的一个个体。凭证标本的保存非常重要，必须有唯一性标本编号、存放、鉴定以及采集等详细信息，以便于日后查证。１犛犖／犜４２７８—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.３．４分子凭证　犿狅犾犲犮狌犾犪狉狏狅狌犮犺犲狉与凭证标本相对应的基因组ＤＮＡ、ＰＣＲ产物、ＤＮＡ条形码序列及峰图，做克隆还应包括含ＤＮＡ条形码片段的阳性转化子。分子凭证的保存非常重要，必须有唯一性的编号、存放等详细信息，以便于日后查证。３．５空白对照　犫犾犪狀犽犮狅狀狋狉狅犾从基因组ＤＮＡ提取步骤开始至ＰＣＲ扩增和ＰＣＲ产物检测整个过程，没有加入任何医学媒介昆虫组织的空白的灭菌洁净１．５ｍＬ离心管，与其他受试的昆虫平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照没有ＰＣＲ产物条带产生。３．６阳性对照　狆狅狊犻狋犻狏犲犮狅狀狋狉狅犾在ＰＣＲ扩增过程中，与受试样品平行进行的，在正常反应情况下，一定能产生ＰＣＲ产物的ＤＮＡ为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有ＰＣＲ产物带产生。３．７阴性对照　狀犲犵犪狋犻狏犲犮狅狀狋狉狅犾在ＰＣＲ扩增过程中，与受试样品平行进行的，用ｄｄＨ２Ｏ代替模板ＤＮＡ而进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否正常，确认没有受到污染，阴性对照没有ＰＣＲ产物条带产生。３．８序列相似度　狊犻犿犻犾犪狉犻狋狔狅犳狋犺犲狊犲狇狌犲狀犮犲狊反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。３．９犉犃犛犜犃格式　犉犃犛犜犃犳狅狉犿犪狋生物信息学术语，又称Ｐｅａｒｓｏｎ格式，是一种用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核苷酸或者氨基酸碱基用单个字母表示，序列的第一行一般用 “＞”起始，随后可以添加序列名或者注释，第二行为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或者氨基酸编码符号，如核苷酸使用ＡＴＧＣ表示，序列中不能出现回车等字符。示例１：＞１ＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＴＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＣＧＡＴＧＣＴＡＧＴＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＴＧ