SN-T 4276-2015 国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４２７６—２０１５国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犻狀狉狅犱犲狀狋狊犫狔狉犲犪犾  狋犻犿犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１５０５２６发布２０１６０１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光犘犆犚检测方法ＳＮ／Ｔ４２７６—２０１５ 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲２号（１０００２９）北京市西城区三里河北街１６号（１０００４５）总编室：（０１０）６８５３３５３３网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数１１千字２０１６年１月第一版　２０１６年１月第一次印刷印数１—１１００ 书号：１５５０６６·２  ２９６０５　定价１４．００元 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京市海淀区疾病预防控制中心、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：田洁、陆琳、郭惠琳、何斌、刘艳华、任彤、赵静、黄恩炯。 Ⅰ犛犖／犜４２７６—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光ＰＣＲ检测方法的检测对象，标本的采集、处理、检测程序。本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌的荧光ＰＣＲ检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２８９４０　病媒生物感染病原体采样规程　鼠类ＧＢ／Ｔ２８９４２　病媒生物感染病原体采样规程　蚤ＳＮ／Ｔ１２４０　国境口岸鼠类监测规程ＳＮ／Ｔ１２９２　国境口岸蚤类监测规程ＷＳ２７９　鼠疫诊断标准人间传染的病原微生物名录（卫生部）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１鼠疫耶尔森菌　犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊俗称鼠疫杆菌，为革兰阴性短粗杆菌，菌体两端钝圆且浓染，亦易被苯胺染料着色，大小为（０．５μｍ～１．０μｍ）×（１．０μｍ～２．０μｍ）。一般分散存在，偶尔成双或呈短链排列，无鞭毛，不形成芽胞。鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原菌，鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的跳蚤叮咬而感染，是我国法定的甲类传染病。鼠疫传染性强，病死率高，易酿成大流行。鼠疫耶尔森菌主要累及皮肤和淋巴结，其次为败血症、肺炎、脑膜炎。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＣＲ：聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）Ｃｔ值：循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）ＰＢＳ缓冲液１犛犖／犜４２７６—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.含０．５％吐温 ２０的ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲液。生理盐水０．９％的氯化钠水溶液。５　实验室生物安全要求按照《人间传染的病原微生物名录》规定，本方法中鼠疫耶尔森菌荧光ＰＣＲ检测应在ＧＢ１９４８９规定的生物安全 Ⅱ级（ＢＳＬ  ２）实验室内进行。６　检测对象６．１　国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌感染者的临床样品。６．２　国境口岸可能携带鼠疫耶尔森菌的医学媒介生物样品。６．３　国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌污染的环境样品。７　主要仪器设备本方法使用的主要仪器如下： — — —实时荧光ＰＣＲ仪； — — —二级生物安全柜； — — —高压灭菌器； — — —－７０℃超低温冰箱（或液氮罐）； — — —普通冰箱； — — —高速台式冷冻离心机（最高转速１３８００犵以上）； — — —微量可调移液器（１０μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）及配套的一次性带滤芯吸头； — — —水浴锅； — — —组织研磨器。８　试剂本方法使用的主要试剂如下： — — —无菌生理盐水或三蒸水； — — —ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ（ＰｒｏｂｅｑＰＣＲ）１）；１）　给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。— — —引物； — — —阳性对照； — — —阴性对照； — — —探针。２犛犖／犜４２７６—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.９　检测程序９．１　样本采集９．１．１　鼠类样品的采集、运输和保存按照ＧＢ／Ｔ２８９４０、ＳＮ／Ｔ１２４０操作；蚤类样品的采集按照ＧＢ／Ｔ２８９４２、ＳＮ／Ｔ１２９２操作。９．１．２　临床样品的采集按照ＷＳ２７９操作。９．１．３　环境样品按无菌技术操作，取适量置于无菌容器中密封保存。９．１．４　在采集过程中做好个人防护。９．２　样品检测９．２．１　核酸提取９．２．１．１　煮沸法提取核酸９．２．１．１．１　以无菌方法称取０．２ｇ粉碎的固体环境样品，加入１ｍＬ的无菌去离子水，充分振荡，２０００ｒ／ｍｉｎ离心４ｍｉｎ，收集上清液，将上清液８０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，收集沉淀；沉淀中加入０．１ｍＬ无菌去离子水，沸水中加热５ｍｉｎ；８０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，上清液作为ＰＣＲ扩增的模板。９．２．１．１．２　以无菌方法吸取液体环境样品（如：水、饮料等）３ｍＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，去上清液，收集沉淀；加入０．１ｍＬ无菌去离子水，沸水中加热５ｍｉｎ；８０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，上清液作为ＰＣＲ扩增的模板。９．２．１．１．３　以无菌方法将０．１ｍＬ血液或体液样品置微型离心管中，沸水中加热５ｍｉｎ；８０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，上清液作为ＰＣＲ扩增的模板。９．２．１．１．４　以无菌方法取人类或鼠类组织样品０．０２５ｇ，用０．１ｍＬ无菌生理盐水或三蒸水研磨；将经过鉴定的适量的蚤加０．１ｍＬ无菌生理盐水或三蒸水研磨，将制得的组织匀浆液转移至离心管中，沸水中加热５ｍｉｎ；８０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，上清液作为ＰＣＲ扩增的模板。９．２．１．２　商品化犇犖犃提取试剂盒提取核酸用商品的ＤＮＡ提取试剂盒处理标本，具体操作参见该试剂盒说明书。９．２．２　荧光犘犆犚９．２．２．１　引物和目的基因本方法使用的引物探针如下： — — —上游引物Ｃａｆｌ  Ｆ：５ ′  ＡＧＧＴＡＡＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＣＣＴＴＧＴＧ  ３ ′ ，位置为３６５ｂｐ ３８７ｂｐ； — — —下游引物Ｃａｆｌ  Ｒ：５ ′  ＣＡＡＴＴＧＡＧＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣ  ３ ′ ，位置为４２０ｂｐ ４４２ｂｐ； — — —探针Ｃａｆｌ  Ｔ：Ｆａｍ  ＡＴＧＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＧＧＣＴＡＣＧＧＧＣＡ  Ｔａｍｒａ，位置为３９２ｂｐ ４１５ｂｐ。９．２．２．２　反应体系反应体系设置为２０μＬ，组成见表１：犛犖／犜４２７６—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书犛犖／犜４２７６—２０１５表１　犜犪狇犿犪狀实时荧光犘犆犚反应体系组　　分使　用　量ＰＣＲ反应液ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（ＰｒｏｂｅｑＰＣＲ）（２×）１０．０μＬＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）０