SN-T 4164-2015 国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４１６４—２０１５国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犛犻狀犱犫犻狊狏犻狉狌狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１５０２０９发布２０１５０９０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：赵锋、刘杨、钟玮、郭慧琳、张华荣、张丽杰、洪烨、王颖、骆星丹、孙肖红。 Ⅰ犛犖／犜４１６４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法１　范围本标准规定了国境口岸入出境人员或蚊类携带辛德毕斯病毒的实时荧光ＰＣＲ和逆转录ＰＣＲ检测方法，包括标本采集、处理、检测程序和结果判定。本标准适用于国境口岸入出境人员或捕获的蚊类携带辛德毕斯病毒的实验室检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１辛德毕斯病毒　犛犻狀犱犫犻狊狏犻狉狌狊辛德毕斯病毒（Ｓｉｎｄｂｉｓｖｉｒｕｓ，ＳＩＮＶ）属于披膜病毒科（犜狅犵犪狏犻狉犻犱犲犪）甲病毒属（犃犾狆犺犪狏犻狉狌狊），为单股正链ＲＮＡ病毒，分子量约４．３×１０６Ｄａ，沉降系数为４２Ｓ～４９Ｓ，具有真核ｍＲＮＡ的典型特征，裸ＲＮＡ具有感染性。辛德毕斯病毒在自然界中的宿主范围广泛，主要以库蚊和伊蚊为传播媒介，临床表现主要为发热、脑膜炎、脑炎、皮肤损害、抽搐、肌无力和皮疹等。３．２实时荧光犚犜  犘犆犚　狉犲犪犾  狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犚犜  犘犆犚实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ方法有多种，本标准采用的是ＴａｑＭａｎ水解探针法，其原理是在常规ＲＴ  ＰＣＲ的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，ＰＣＲ扩增时，利用Ｔａｑ酶的５’ ３’外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与ＰＣＲ产物形成完全同步。３．３犚犜  犘犆犚　狉犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀逆转录聚合酶链式反应，由依赖ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合酶（逆转录酶）将一条ＲＮＡ链逆转录成为互补ＤＮＡ，再以此为模板，由依赖ＤＮＡ的ＤＮＡ聚合酶通过ＰＣＲ进行扩增。３．４犆狋值　犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。１犛犖／犜４１６４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.４　检测对象疑似感染的入出境人员血清和入出境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。５　实验室生物安全要求５．１　检测工作中的个人防护参照ＧＢ１９４８９。５．２　实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３对生物安全二级（ＢＳＬ  ２）及以上实验室的生物安全要求。５．３　使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理。６　主要仪器设备本方法使用的主要仪器设备包括： — — —荧光定量ＰＣＲ仪； — — —普通ＰＣＲ仪； — — —电泳仪； — — —凝胶成像系统； — — —二级生物安全柜； — — —高压灭菌器； — — —－７０℃超低温冰箱； — — —高速冷冻离心机； — — —组织匀浆机等。７　主要试剂本方法使用的主要试剂包括： — — —样本制备及检测试剂：ＲＮＡ保护剂、无水乙醇、琼脂糖、Ｇｏｌｄｖｉｅｗ、２０Ｕ／μＬＲＮＡ酶抑制剂、２００Ｕ／μＬＭ  ＭＬＶ逆转录酶、５Ｕ／μＬＴａｑ酶、１μｇ／μＬｏｌｉｇｄ（Ｔ）、ＤＥＰＣＨ２Ｏ、１０×ＰＣＲ缓冲液（含Ｍｇ２＋）、５×ＲＴ  ＰＣＲ缓冲液等。 — — —ＲＮＡ提取试剂盒：ＱｌＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＫｉｔ１），内含ＡＶＬ、ＡＷ１、ＡＷ２和ＡＶＥ等成分。 — — —实时荧光ＰＣＲ试剂盒：Ａｇ Ｐａｔｈ  ＩＤＴＭＯｎｅｓｔｅｐＲＴ  ＰＣＲＫｉｔ２）。 — — —实时荧光ＲＴ  ＰＣＲ检测目的片段为狀狊狆犾基因，引物和探针如下：上游引物：５’ ＧＴＴＣＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＴ  ３ ’下游引物：５’ ＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＣＧＧＡＡＡＡＣＡ  ３ ’探针序列：５’ＦＡＭ  ＴＴＧＧＡＣＡＴＡＧＧＣＡＧＣＧＣＡ  ＢＨＱ１３ ’ — — —逆转录ＰＣＲ检测目的片段为部分Ｅ２和６Ｋ蛋白基因，引物如下：上游引物：５’ ＡＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣ  ３ ’ １）　德国Ｑｉａｇｅｎ公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。２）　美国Ａｍｂｉｏｎ公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。２犛犖／犜４１６４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.下游引物：５’ ＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＧＧＴＡ  ３ ’上下游引物合成后用纯水溶解并分装冻存于冰箱内，引物浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ。上下游引物扩增核酸片段长度为５６３ｂｐ。８　检测程序８．１　样本的采集与保存运输８．１．１　人血清样本使用不含抗凝剂的真空采血管无菌收集人静脉血３ｍＬ～５ｍＬ，室温静置３０ｍｉｎ，待血液凝固后，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上层血清于无菌合适的容器中并加贴标签，立即将容器置于冰屑或冰水混合物中送实验室检测或－７０℃以下保存。８．１．２　蚊虫样本捕获的蚊虫麻醉后，快速分拣，分拣过程宜在简易低温装置上进行。分拣后按蚊虫种类每３０只为一份（不足３０只以一份计），装入适当的容器（如冻存管、离心管、塑料平皿等），并加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。分装完毕的标本，送实验室检测或－７０℃以下保存。８．２　样本处理８．２．１　人血清样本的处理血清样本无需处理可直接提取核酸，如不及时检测应在－７０℃以下保存。８．２．２　蚊虫样本的处理将待检蚊虫样本倒入研磨器中，加入ＲＮＡ保护剂，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入１．５ｍＬＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ离心管，平衡后，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。取上清液提出核酸，剩余的蚊虫标本研磨液需保存在－７０℃以下超低温冰箱以备复查。８．３　病毒犚犖犃提取按照ＲＮＡ提取试剂盒操作指导书操作。８．４　实时荧光犚犜  犘犆犚检测８．４．１　反应液的准备设置２５μＬ反应体系，每个待检样本反应液的组成为：无ＲＮＡ酶的灭菌双蒸水５．２μＬ，ＲＴ ＰＣＲＭｉｘ１２．５ μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ上游引物０．５μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ下游引物０．５μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ探针０．３μＬ，荧光ＲＴ  ＰＣＲ酶１．０μＬ，模板ＲＮＡ５．０ μＬ。８．４．２　扩增程序扩增程序为：４５℃、１０ｍｉｎ，１个循环；９５℃、１５ｍｉｎ，１个循环；９５℃、１５ｓ→６０℃、３０ｓ（检测荧光信号），４０个循环。由于不同的荧光定量ＰＣＲ仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。