书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ １ ４ １—２ ０ １ ５ 畜及畜产品中糖皮质激素残留量检测方法 　酶联免疫法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 犵犾 狌 犮 狅 犮 狅 狉 狋 犻 犮 狅 犻 犱狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀犾 犻 狏 犲 狊 狋 狅 犮 犽犪 狀 犱犾 犻 狏 犲 狊 狋 狅 犮 犽狆狉 狅 犱 狌 犮 狋 狊—犈 狀 狕狔犿 犲  犾 犻 狀 犽 犲 犱犻 犿犿 狌 狀 狅 狊 狅 狉 犫 犲 狀 狋犪 狊 狊 犪 狔 ２ ０ １ ５０ ２０ ９发布 ２ ０ １ ５０ ９０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
u5[PO –0
SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国上海出入境检验检疫局 。本标准主要起草人 ：韩伟、王赢、袁辰刚、朱坚。 Ⅰ犛 犖／犜４ １ ４ １—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
u5[PO –0
SÑU.畜及畜产品中糖皮质激素残留量检测方法 　酶联免疫法 １　范围 本标准规定了畜及畜产品中地塞米松 、泼尼松龙 、氟地塞米松 、异氟泼尼龙 、倍他米松 、去炎松和氟米龙等糖皮质激素残留量的抽样 、制样和酶联免疫测定方法 。本标准适用于畜产品 （牛、猪、羊等内脏组织与肌肉组织 ） 、牛奶和动物尿液中地塞米松 、泼尼松龙 、氟地塞米松 、异氟泼尼龙 、倍他米松 、去炎松和氟米龙等糖皮质激素残留量的筛选检验 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　试样的缩分和保存 ３．１　试样缩分 ３．１．１　组织样品 ：从全部样品 （包括牛奶 ）中取有代表性样品 ，去除脂肪 、充分绞碎 、混匀，用四分法缩分出不少于 ５ ０ ０ｇ试样。 ３．１．２　动物尿样 ：从饲养现场收集动物尿液 ，充分混匀 、澄清后，装入清洁密闭容器 ，试样不少于 ５ ０ｍＬ。 ３．２　样品容器 样品应装于合适的清洁干燥容器中 ，以保持样品的完整性和可追溯性 。可采用聚乙烯塑料容器 ，玻璃容器等惰性材料容器 （不允许使用橡胶容器 ）盛装样品 ，然后再放入较大的干净容器中密封装运 。 ３．３　样品封识 应在每个样品容器的外表贴上标签 ，标签上注明样品名 、样品编号 、生产批号 、抽样日期 、抽样地点 、堆位、抽样人员 ，并由抽样人员或官方人员加封 。 ３．４　样品保存 ３．４．１　抽样后样品应立即在 －１ ８℃以下冷冻保存 ，０～５℃条件下４ ８ｈ内送达实验室 。 ３．４．２　在抽样和制样过程中 ，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。 ４　测定方法 ４．１　原理 本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应 。微孔板上包被有绵羊抗兔 ＩｇＧ的抗体，加入特异性抗 １犛 犖／犜４ １ ４ １—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
u5[PO –0
SÑU.体（兔抗地塞米松抗体 ） 、酶标记泼尼松龙 、地塞米松标准品或样品提取液后 ，特异性抗体与包被的绵羊 抗兔ＩｇＧ抗体结合 ，同时游离糖皮质激素和酶标记泼尼松龙竞争性的与特异性抗体结合 。通过洗涤除 去未结合的糖皮质激素的酶标记泼尼松龙 ，然后加入底物显色 ，用酶标仪测定吸光度 ，根据吸光度值得 出试样中糖皮质激素的含量 。 ４．２　试剂和材料 除去另外说明外 ，所有试剂均为分析纯 ，水为Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ４．２．１　糖皮质激素酶联免疫测定试剂盒 ：应能满足本方法测定低限要求 ，参见附录 Ａ和附录Ｂ。 ４．２．２　乙酸乙酯 。 ４．２．３　正己烷。 ４．２．４　甲醇。 ４．２．５　０． １ｍ ｏ ｌ／Ｌ氢氧化钠溶液 。 ４．２．６　半对数坐标纸 。 ４．２．７　地塞米松标准品 。 ４．３　仪器和设备 ４．３．１　酶标仪。 ４．３．２　均质器。 ４．３．３　离心机。 ４．３．４　氮气挥发器 。 ４．３．５　振荡器。 ４．３．６　微量加样器 ：１ ０μＬ～１ ０ ０μＬ，２ ０μＬ～２ ０ ０μＬ。 ４．３．７　微量多通道加样器 ：１ ０μＬ～１ ０ ０μＬ。 ４．４　分析步骤 ４．４．１　提取 ４．４．１．１　组织样品 （肌肉，肝脏，肾等） 称取组织试料 ２ｇ±０． ０ ５ｇ于５ ０ｍＬ离心管中 ，加乙酸乙酯 １ ５ｍＬ，旋涡混合 ，１ ５℃３０ ０ ０ 犵离心 １ ０ｍ ｉ ｎ，移取乙酸乙酯层 。于离心残渣中加 ０． １ｍ ｏ ｌ／Ｌ氢氧化钠溶液 １ ０ｍＬ，混匀，加乙酸乙酯 １ ５ｍＬ， 旋涡振荡 １ ５ｍ ｉ ｎ，移取乙酸乙酯层 。合并两次提取液后 ，吹蒸干（置４ ０℃氮气流中 ） ，用２ｍＬ样品稀释 缓冲液溶解供测定用 。最后样品稀释倍数为 １． ０。 ４．４．１．２　牛奶 取牛奶试料 ２ｍ Ｌ±０． ０ ５ｍ Ｌ 于５ ０ｍＬ离心管中 ，加乙酸乙酯 ２ ０ｍＬ，旋涡混合 １ ５ｍ ｉ ｎ，１ ５℃３０ ０ ０ 犵离心１ ０ｍ ｉ ｎ，移取乙酸乙酯层 ，置４ ０℃氮气流中吹干 ，用２ｍＬ样品稀释缓冲液 ，振荡溶解供测定用 。 最后样品稀释倍数为 １． ０。 ４．４．１．３　动物尿样 取待测动物尿样 ２ｍＬ，１ ５℃３０ ０ ０ 犵离心１ ０ｍ ｉ ｎ，取０． ５ｍＬ 澄清尿液 ，用样品稀释缓冲液稀释至 １ｍＬ，混合均匀供测定用 。最后样品稀释倍数为 ２． ０。 ２犛 犖／犜４ １ ４ １—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
u5[PO –0
SÑU.４．４．２　测定条件 ４．４．２．１　操作条件 所有操作应在室温下 （２ ０℃～２ ４℃）进行，糖皮质激素酶联免疫测定试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温 （２ ０℃～２ ４℃）后方可使用 。 ４．４．２．２　洗板条件 人工洗涤次数 ３次以上，每次注水量为 ３ ０ ０μＬ；自动洗板可以预定 ３次周期。 ４．４．２．３　酶标仪测定条件 酶标仪测定波长为 ４ ５ ０ｎ ｍ。 ４．４．３　测定步骤 １） ４．４．３．１　测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头 。 ４．４．３．２　将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架 （标准液和样液分别做复孔 ） ，记录标准液和样液的位置。将不用的微孔条放入带有干燥剂的锡箔袋中 。 ４．４．３．３　用试剂盒配制的洗涤液 ，加３ ０ ０μＬ至每个微孔 ，洗涤３次，最后在吸水纸上拍干 。 ４．４．３．４　取５ ０μＬ标准液和待测样品加入各微孔中 。 ４．４．３．５　每孔内加入 １ ０ ０μＬ酶标记物 ，然后再加入 １ ０ ０μＬ的相应抗体 。 ４．４．３．６　振荡混匀后 ，微孔板置 ２℃～８℃下孵育２ｈ。 ４．４．３．７　倒出微孔中的液体 ，将微孔架倒置在吸水纸上拍打数次 ，每个微孔注满标准洗涤液清洗后倒掉拍干，重复以上洗板操作 ３次；或使用自动洗板机操作 。 ４．４．３．８　每孔加１ ５ ０μＬ显色液（底物和发色剂 １∶１混合） ，室温避光孵育 ３ ０ｍ ｉ ｎ。 ４．４．３．９　迅速加５ ０μＬ反应终止液至每个微孔中 ，轻拍混匀后 ，用４ ５ ０ｎ ｍ 波长测定吸光度值 。 ４．４．４　平行试验 按以上步骤 ，对同一标准溶液 、同一样品溶液均应进行平行试验测定 。 ４．４．５　空白试验 除不称取试样外 ，均按上述步骤进行 。 ４．４．６　质控点试验 每次测定均应做一个添加地塞米松标准品的样品 ，添加浓度为相应产品的最高残留限量 。 ５　结果计算 ５．１　计算百分比吸光度值 计算糖皮质激素标准液和样液的平均吸光度值 ，按式（１）分别求得每个糖皮质激素标准液和样液的百分比吸光度值 ： １）　给出该信息是为了方便本标准的使用者 ，并不表示对某一产品操作步骤的认可 。如果其他产品的操作步骤有 不同，需经实验评估后采用 。 ３犛 犖／犜４ １ ４ １—２ ０ １ ５ rHgCb@g · ykbûR60
u5[PO –0
SÑU.犃＝犛犛０×１ ０ ０％ …………………………（ １） 　　式中： 犃— — —百分比吸光度值 ； 犛— — —５ｎｇ／ｍＬ、２． ０ｎｇ／ｍＬ、１． ０ｎｇ／ｍＬ、０． ５ｎｇ／ｍＬ、０． ２ｎｇ／ｍＬ、０． １ｎｇ／ｍＬ、０ｎｇ／ｍＬ的糖皮质激素标准液或样液的平均吸光度值 ； 犛０— — —０ｎｇ／ｍＬ的糖皮质激素标准液的平均吸光度值 。 ５．２　绘制校正曲线 以吸光度的百分比值为纵坐标 （％） ，糖皮质激素标准溶液浓度 （ｎｇ／ｍＬ）的对数值为横坐标 ，绘制标准工作曲线 。每次试验均应重新绘制标准工作曲线 。 ５．３　结果的表述 在５． ２绘制的校正曲线上读取样液百分比吸光度值所对应的糖皮质激素浓度 ，乘以稀释倍数后即为试样中的糖皮质激素残留量 （μｇ／ｋｇ） 。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算 。所得结果精确至一位小数 。 ６　确证试验 如被测样品中残留物的残留量大于限量要求时 ，应用其他方法进行确证 。 ７　本方法测定低限 ７．１　地塞米松 、泼尼松龙 、氟地塞米松 、异氟泼尼龙的测定低限为 ０． ２ ０μｇ／ｋｇ。 ７．２　倍他米松 、去炎松的测定低限为 ０． ２ ５μｇ／ｋｇ。 ７．３