SN-T 4104-2015 猪支原体肺炎检疫技术规范

书书书　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜４１０４—２０１５猪支原体肺炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪犺狔狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲２０１５０２０９发布２０１５０９０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、重庆动物疫病预防控制中心、西南大学、重庆正大有限公司。本标准主要起草人：聂福平、杨俊、张强、李应国、曾政、王昱、肖进文、程光胜、王豪举、夏明星。 Ⅰ犛犖／犜４１０４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.猪支原体肺炎检疫技术规范１　范围本标准规定了猪支原体肺炎的病理学诊断方法、病原分离和鉴定方法、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应试验。本标准适用于猪支原体肺炎的检疫、诊断、流行病学调查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ４７８９．２８　食品安全国家标准　食品微生物学检验　培养基和试剂的质量要求ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＷＳ２３３—２００２　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１猪支原体肺炎（犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪犺狔狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲）猪支原体肺炎又称猪气喘病，猪地方流行性肺炎，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性呼吸系统传染病，是造成养猪业经济损失最重要的疾病之一。该病以咳嗽和气喘为主要临床特征，病变部位主要在肺部，可见心叶、中间叶和尖叶有融合性支气管肺炎变化。该病广泛流行于世界各地，欧洲、亚洲、美洲以及大洋洲等主要养猪国家和地区均有发生。４　实验室生物安全要求４．１　检测工作中的个人防护参照ＧＢ１９４８９。４．２　实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３—２００２对生物安全２级（ＢＳＬ  ２）实验室的生物安全要求。４．３　使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理。５　临床和病理学诊断５．１　临床症状猪支原体肺炎是一种发病率高死亡率低的慢性呼吸道传染病，主要临床症状为慢性干咳。新发病猪群常呈急性，张口喘气，痉挛性阵咳，体温升高不明显。咳嗽持续几周甚至数月，育肥猪咳嗽最严重。部分患猪呈腹式呼吸，喘息沟明显。患猪食欲减退，消瘦，被毛粗糙，生长停滞。该病病程主要分急性、１犛犖／犜４１０４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.慢性两种类型。５．２　病理学特征主要病变见于肺、肺门淋巴结和纵隔淋巴结。急性死亡患猪肺有不同程度的水肿和气肿。肉眼病变类似于膨胀不全的肺，尤其在疾病的慢性阶段。特征性病变是两肺的心叶、尖叶和膈叶前缘发生对称性的实变，肺门淋巴结肿大，肺中间叶实变，以及肺门淋巴结肿大、增生。病变最初为栗粒大至豆大呈均匀散布，逐渐扩展而融合成支气管肺炎。病变部界限明显，灰白色，无弹性，呈“胰样” “鱼肉样” 。切开时，内有大量泡沫。其他器官无明显变化。５．３　病理组织学检查典型病变组织通过常规的病理学检查，支气管和细支气管上皮组织纤毛数量减少，小支气管周围的肺泡扩大，泡腔充满多量炎性渗出物，肺泡间组织有淋巴样细胞增生。急性病例中，扩张的泡腔内充满浆液性渗出物，杂有单核细胞、中性粒细胞、少量淋巴细胞和脱落的肺泡上皮细胞。慢性病例中，其肺泡腔内的炎性渗出物中主要是淋巴细胞浸润。５．４　犡线检查Ｘ线检查对本病的诊断有重要价值，对可疑患猪进行Ｘ线透视，可做出诊断。在Ｘ线检查时，猪只以直立背胸位为主，侧位或斜位为辅。病猪在肺野的内侧区以及心膈角区呈现絮状及片状阴影。６　病理分离和鉴定６．１　材料准备６．１．１　Ａ２６肉汤：制备方法见附录Ａ。６．１．２　固体培养基：制备方法见附录Ａ。６．１．３　厌气肉肝汤：制备方法见附录Ａ。６．１．４　血琼脂平板：按ＧＢ４７８９．２８的方法配制。６．１．５　Ｈａｎｋ’ｓ液：配制方法见附录Ａ。６．１．６　０．２５％鸡红细胞液：制备方法见附录Ａ。６．１．７　灭菌干棉拭子。６．２　病料采集６．２．１　活体病料采集：用棉拭子深擦拭病猪的喉头或鼻腔，采集呼吸道分泌物。６．２．２　死后病料采集：无菌采取病键交界处肺组织。６．３　病原分离将病肺组织剪成小于２ｍｍ３的碎块，浸入Ｈａｎｋ’ｓ液中洗涤，除去血液和组织碎块，取３块～５块浸泡在盛有５ｍＬＡ２６肉汤的试管中；棉拭子浸入１０ｍＬＡ２６肉汤中清洗，并压出棉花中残液，再经０．４５μｍ的滤膜过滤除菌，将滤液分装于试管中。将上述试管置于含５％～１０％ＣＯ２环境或用胶塞塞紧管口，在３７℃下进行培养。１代～３代分离时，须每经３ｄ～５ｄ，以２０％的接种量连续进行移植；４代～５代以后，再经５ｄ～７ｄ连续转移以提高分离率。同时应设厌氧肉肝汤、血琼脂平板作为细菌检查的对照。通过连续传代，当培养物出现有规则的变化时，应涂片镜检；同时将液体培养物作适当稀释后再接２犛犖／犜４１０４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.种于固体培养基上，在含５％～１０％ＣＯ２环境中３７℃下培养３ｄ～１０ｄ。培养时应逐日在低倍镜下观察，若出现圆形、边缘整齐、似露滴状、中央有颗粒、稍隆起的小菌落，判为可疑菌落，需进一步进行鉴定。６．４　生化鉴定６．４．１　溶血试验挑取可疑菌落接种含猪或鸡红细胞的固体培养基上培养２ｄ～３ｄ，如为猪肺炎支原体，则菌落周围无溶血现象。６．４．２　精氨酸试验挑取可疑菌落接种于含精氨酸及酚红指示剂的液体培养基中，由于猪肺炎支原体不能分解精氨酸产生氨，故如果指示剂不变色，试验为阴性，反之，则猪肺炎支原体为阳性。６．４．３　薄膜和斑点形成试验挑取可疑菌落接种于含马血清的固体培养基上，由于猪肺炎支原体不能分解其中的脂肪酸，故如果在固体培养基上菌落的表面和周围不能形成薄膜和斑点，试验为阴性，反之，则猪肺炎支原体为阳性。６．４．４　红细胞吸附试验将０．２５％鸡红细胞液滴加于可疑菌落上，静止后弃去红细胞液，用生理盐水冲洗２次～３次，用低倍镜检查，如为猪肺炎支原体，可见菌落表面和周围吸附有大量红细胞。６．４．５　结果判定以上试验皆为阳性者判为猪肺炎支原体。７　间接血凝试验７．１　材料准备７．１．１　９６孔（１２×８）Ｖ型反应板，微量移液器，微量振荡器等。７．１．２　猪肺炎支原体纯化灭活抗原，阳性血清，阴性血清。７．１．３　致敏红细胞：为猪肺炎支原体纯化灭活抗原致敏的雄性绵羊红细胞。７．１．４　稀释剂：含１％健康兔血清０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．２）。７．２　操作方法７．２．１　血清的处理取被检血清０．２ｍＬ于无菌小试管中，５６℃水浴３０ｍｉｎ灭活，冷却后加入０．３ｍＬ２％戊二醛红细胞悬液，摇匀，置３７℃水浴３０ｍｉｎ，离心后吸出血清供检验用。阳性血清、阴性血清的处理同被检血清。７．２．２　血凝试验见表１。３犛犖／犜４１０４—２０１５ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.表１　猪肺炎支原体间接血凝试验孔号１２３４５６７８９１０１１１２稀释倍数１∶５１∶１０１∶２０１∶４０１∶８０１∶１６０１∶３２０１∶６４０１∶１２８０１∶２５６０对照稀释剂２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５被检血清２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５弃去２５２％致敏红细胞２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５２５作用时间及温度震荡３０ｓ后，室温（１８℃～２５℃）静置２ｈ判定举例＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－７．２．３　操作步骤７．２．３．１　用微量移液器先向反应板每孔中加入２５μＬ稀释剂，再向第１孔加入２５μＬ已处理好的被检清，充分混匀后，吸取２５