书书书　 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2B /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 犛 犖／犜３ ８ ４ １—２ ０ １ ４ /G28 /G32 /G33 /G34 /G21 /G35 /G36 /G37 /G38 /G26 /G39 /G3A /G37 /G38 /G3B /G3C /G3D /G2B /G3E　 /G3F /G40 /G41 /G42 /G43 /G44 /G45 /G46 /G47 /G48 /G49 /G4A（犚 犜  犔 犃犕犘 ） /G4B 犚 犪狆犻 犱犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳狀 狅 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊犪 狀 犱犪 狊 狋 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊 犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺犳 狅 狉犲 狓 狆狅 狉 狋—犚 犲 狏 犲 狉 狊 犲狋 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 狆狋 犻 狅 狀  犾 狅 狅狆 犿 犲 犱 犻 犪 狋 犲 犱犻 狊 狅 狋 犺 犲 狉 犿 犪 犾犪 犿 狆犾 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ４０ １１ ３ /G4C /G4D ２ ０ １ ４０ ８０ １ /G4E /G4F /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E /G2D /G2F /G30 /G31/G4C /G4D rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国北京出入境检验检疫局 。本标准主要起草人 ：魏海燕、曾静、马丹、张西萌、张蕾。 Ⅰ犛 犖／犜３ ８ ４ １—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口贝类中诺如病毒和星状病毒的快速检测　反转录环介导恒温核酸扩增（犚 犜  犔 犃犕犘 ）法 １　范围 本标准规定了贝类中诺如病毒和星状病毒的反转录 环介导恒温核酸扩增 （ＲＴ  ＬＡＭＰ ）快速检测法。本标准适用于贝类中诺如病毒和星状病毒的快速检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ１ ９ ４ ８ ９ 　实验室　生物安全通用要求 Ｇ Ｂ／Ｔ２ ７ ４ ０ ３ 　实验室质量控制规范 　食品分子生物学检测 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ６ ３ ５　贝类中诺沃克病毒检测方法 　普通ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 方法和实时荧光 ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 方法 Ｓ Ｎ／Ｔ２ ５ １ ９　贝类中星状病毒检测方法 　普通Ｐ Ｃ Ｒ和实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ方法 ３　缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ３．１　Ｂ ｅ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ：甜菜碱。 ３．２　犅 狊 狋酶：犅 狊 狋ＤＮＡｐｏ ｌｙｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ（ｌ ａ ｒｇｅｆ ｒ ａｇｍ ｅ ｎ ｔ） ，犅 狊 狋ＤＮＡ聚合酶（大片段） 。 ３．３　ｄ ＮＴ Ｐ：ｄ ｅ ｏ ｘｙｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｓ ｉ ｄ ｅｔ ｒ ｉ ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ｅ，脱氧核苷三磷酸 。 ３．４　ＬＡＭＰ：ｌ ｏ ｏｐ ｍ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ａ ｌａ ｍ ｐｌ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ，环介导恒温扩增 。 ３．５　ＲＮＡ：Ｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｃａ ｃ ｉ ｄ ，核糖核酸 。 ４　技术概要 利用Ｇ Ｐ ＴＴ法（Ｇ ｌｙｃ ｉ ｎ ｅ  Ｐ ＥＧ  Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ  ｏ ｌ ｉ ｇｏｄ Ｔ）或纳米磁珠法提取贝类样品中的病毒 ＲＮＡ；分别选取星状病毒衣壳蛋白编码基因 （ＯＲ Ｆ ２）５’端、ＧⅠ型和ＧⅡ型诺如病毒 ＯＲ Ｆ １与ＯＲ Ｆ ２接头处的高度保守序列，设计５条～６条ＲＴ  ＬＡＭＰ 引物，特异性识别病毒 ＲＮＡ上的７个～８个独立区域 ，在具有链置换作用的 犅 狊 狋酶、ＡＭＶ反转录酶作用下 ，于等温条件 （６ ３℃或６ ５℃）保温６ ０ｍ ｉ ｎ，即可一步实现对病毒 ＲＮＡ的高效扩增 。扩增反应产生大量副产物 （焦磷酸镁 ）形成乳白色沉淀 ，在反应管中加入 Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎⅠ荧光染料 ，阳极反应呈荧光绿色 ，而阴性反应为荧光橙色 。 ５　试剂和材料 除有特殊说明外 ，所有实验用试剂均为分析纯 ；实验用水符合 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的要求 。 １犛 犖／犜３ ８ ４ １—２ ０ １ ４ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.５．１　引物：ＲＴ  ＬＡＭＰ 扩增引物序列见表 １，引物设计示意图参见附录 Ａ。 表１　犚 犜  犔 犃犕犘 扩增引物 病毒名称 引物名称 序列（５’ ３’ ） 星状病毒外侧上游引物 （Ａ ｓ ｔ  Ｆ ３）Ｇ ＣＡＧＧＴＡＡＣ ＴＧＴＴＧＡＧＧＴ ＣＡ 外侧下游引物 （Ａ ｓ ｔ  Ｂ ３）ＧＧＴＴＴＴＧＧＴ Ｃ Ｃ ＴＧＴＧＡＣＡＣ Ｃ 内侧上游引物 （Ａ ｓ ｔ  Ｆ Ｉ Ｐ ）Ｃ ＴＧ Ｃ Ｔ Ｃ ＴＧＴ Ｃ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ ＴＡＡＴＧＧ Ｃ Ｃ Ｇ ＣＡＡＣＡＧＧＡＧＴＡ 内侧下游引物 （Ａ ｓ ｔ  Ｂ Ｉ Ｐ ）ＡＧＧＡＣ ＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧ Ｃ Ｃ Ｃ ＧＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＡＣ ＧＧＡＣＡＣ ＧＴ 环状上游引物 （Ａ ｓ ｔ  Ｌ Ｆ）ＴＴＧＴＧＡＧ Ｃ ＧＧＧ Ｃ Ｃ Ｃ ＴＴＧ 环状下游引物 （Ａ ｓ ｔ  Ｌ Ｂ）Ｃ Ｇ Ｃ ＧＧ ＣＡＡＡＣＡＴ ＣＡＡＴ Ｃ ＴＴ Ｃ Ｔ ＣＡ ＧⅠ型诺如病毒外侧上游引物 （ＧⅠ Ｆ ３）Ｔ Ｃ ＴＡＣＡＴＴ Ｃ Ｃ ＴＧＧＧＴＧＧ ＣＡ 外侧下游引物 （ＧⅠ Ｂ ３）Ｃ Ｃ ＣＡＧ Ｃ ＴＡＣ ＴＧＧＴＴ Ｃ ＣＡＴＴＧ 内侧上游引物 （ＧⅠ Ｆ Ｉ Ｐ）ＡＧＧＡＧＡＴ Ｃ Ｇ Ｃ ＧＡＴ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ＴＧＴ Ｃ Ｃ ＣＡＴＧＴＴ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ ＴＧＧＡＴＧ Ｃ 内侧下游引物 （ＧⅠ Ｂ Ｉ Ｐ）Ｇ Ｃ ＧＴ Ｃ ＴＡＡＧＧＡＣ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ ＣＡＡＣ ＧＧ Ｃ Ｔ ＣＡＧ Ｃ ＴＧＴＡＴＴＴＧ Ｃ Ｃ Ｔ 环状上游引物 （ＧⅠ Ｌ Ｆ）ＡＣＡＴＧ Ｃ Ｔ ＣＡＧＡＴ ＣＡＴＧＧＡＡＧ Ｃ ＧⅡ型诺如病毒外侧上游引物 （ＧⅡ Ｆ ３）Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ ＣＡＡＣ ＣＡＴＧＡＡＧＡＣ Ｃ 外侧下游引物 （ＧⅡ Ｂ ３）ＡＣ ＧＴＧ Ｃ Ｔ ＣＡＧＡＴ Ｃ Ｃ ＧＡＧＡＡ 内侧上游引物 （ＧⅡ Ｆ Ｉ Ｐ）ＧＡＡＴＧ Ｃ ＴＧＧＧ Ｃ Ｃ ＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＴＡＣ ＣＡＣＡＣ Ｔ Ｃ Ｃ ＣＡＧＡＧＧ 内侧下游引物 （ＧⅡ Ｂ Ｉ Ｐ）ＴＧ ＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧ Ｃ Ｃ ＣＡＴ Ｃ ＴＧＡＡＣＡＴ Ｃ ＧＧ Ｃ Ｔ Ｃ ＴＴ 环状上游引物 （ＧⅡ Ｌ Ｆ）Ｃ ＣＡＴ ＣＡＡＡＧＡＣＡＴ ＣＡＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧ 　　注：ＲＴ  ＬＡＭＰ 引物的设计分别参照 １型星状病毒 Ｐ ｕ ｎ ｅ／０ ６ ３ ６ ８ １／Ｉ ｎ ｄ ｉ ａ毒株的衣壳蛋白编码基因 （ＯＲ Ｆ ２）５’端核 酸高度保守序列 （ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎＮ ｏ． Ｊ Ｆ ３ ２ ７ ６ ６ ６ ） 、ＧⅠ型和ＧⅡ型诺如病毒 ＯＲ Ｆ １与ＯＲ Ｆ ２接头处高度保守序列 （ＧⅠ型诺如病毒 ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎＮ ｏ． Ｕ ０ ４ ４ ６ ９ ，ＧⅡ型诺如病毒 ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎＮ ｏ． Ｘ ８ ６ ５ ５ ７ ） 。 ５．２　ＡＭＶ反转录酶 ：１ ０Ｕ／μＬ。 ５．３　ｄ ＮＴ Ｐ：１ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ５．４　犅 狊 狋酶：８Ｕ／μＬ。 ５．５　１ ０×Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ Ｐ ｏ ｌ 缓冲液：含２ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＴ ｒ ｉ ｓ  ＨＣ ｌ （ｐＨ８． ８） 、１ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ（ＮＨ４）２Ｓ Ｏ４、１ ０ ０ｍｍ ｏ ｌ ／ＬＫ Ｃ ｌ、２ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ，ＭｇＳ Ｏ４、１％Ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎＸ  １ ０ ０ 。 ５．６　ＭｇＳ Ｏ４：５ ０ｍｍ ｏ ｌ ／Ｌ。 ５．７　甜菜碱：５ｍ ｏ ｌ／Ｌ。 ５．８　显色液：浓度为１０ ０ ０×Ｓ Ｙ Ｂ ＲＧ ｒ ｅ ｅ ｎ Ⅰ。 ５．９　阳性对照 ：ＧⅠ型诺如病毒 ／ＧⅡ型诺如病毒 ／星状病毒阳性样本由具备相关资质的实验室提供 ，添加于已知的阴性贝类样品中 ，制成阳性质控样品 ；也可选用含扩增目的基因的体外转录 ＲＮＡ分子（经荧光ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 验证，紫外分光光度计进行定量后 ，稀释成１ ０ ０拷贝／μＬ，分装成小份冻存于 －８ ０℃，避免反复冻融 ，保存期限可达一年 ）作为ＲＴ  ＬＡＭＰ 扩增时的阳性对照 ，病毒目的基因序列参见附录 Ａ。 ６　仪器和设备 ６．１　移液器：量程分别为 ０． ５μＬ～１ ０μＬ、１ ０μＬ～１ ０ ０μＬ、１ ０ ０μＬ～１０