ICS65.020.01 CCS B 04 NY 中华人民共和国农业行业标 NY/T 3949—2021 植物源性食品中酚酸类化合物的测定 高效液相色谱一串联质谱法 Determination of phenolic acids in foods of plant origin by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2021-11-09发布 2022-05-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3949—2021 全国农业全品标准 食典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出。 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口。 本文件起草单位：农业农村部食物与营养发展研究所、北京市营养源研究所、中国标准化研究院、内蒙 古蒙牛乳业集团有限公司、中国合格评定认可委员会、北京市理化分析测试中心、国家蔬菜工程技术研究 中心、中检集团中原农食产品检测（河南）有限公司。 本文件主要起草人：朱大洲、崔亚娟、徐佳佳、孔凡华、白沙沙、孙君茂、史波林、黄家章、刘鹏、梁克红、 赵欣、杨春雪、罗欣、李东、马文丽、杨志刚、宋晓东、李宏、马杰、贾丽、刘光敏、赵雪梅、宗珊盈。 NY/T 3949—2021 植物源性食品中酚酸类化合物的测定 高效液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件规定了植物源性食品中酚酸类化合物的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于果蔬及其制品、谷物、茶叶、药食 直物源性食品中阿魏酸、对羟基苯甲酸、对-香豆 酸、丁香酸、龙胆酸、芥子酸、咖啡酸、没食子酸、水杨酸、香草酸、异阿魏酸、原儿茶酸、2-羟基肉桂酸、2，3 二羟基苯甲酸、2,3，4-三羟基苯甲酸、3-羟基肉桂酸含量的测定 2规范性引用文件 RD 用而构成 日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用 文件 用文件，其最新版 的括所不 的修 单）适用于本文件。 GB/T6682 T 验室用水 规格利 验方法 3术语和定义 异定的 本文件没有需要 语和定义 RA 4原理 试样经碱性水解 液提取 马酚酸类化合物，采用高效液相色 质 谱法测定，外标 水为游 法定量。 5试剂与材料 5.1试剂 5.1.17 水:GB/T 668 规定自 5. 1.2 氢氧化钠(N 5.1.3 盐酸（HCI)：优 5. 1. 4 乙酸乙酯（CHC H,CH 5.1.5 乙睛（CHCN）：色谱 5. 1.6 甲醇(CHOH)：色谱纯 5. 1.7 抗坏血酸（CH.O）：优级纯 5. 1.8 乙二胺四乙酸（CloH6NzO：）：优级纯 5.2试剂配制 5.2.1氢氧化钠溶液（3mol/L，含1%抗坏血酸和0.3%乙二胺四乙酸）：称取120g氢氧化钠（5.1.2）、 10g抗坏血酸（5.1.7）、3.0g乙二胺四乙酸（5.1.8)，加入700mL水中，待溶解后转移至1000mL容量瓶 中，用水定容至刻度。 5.2.2盐酸溶液（6mol/L）：量取50mL盐酸（5.1.3），缓慢注入50mL蒸馏水中，混匀。 5.2.370%甲醇水溶液：取70mL甲醇（5.1.6)和30mL水，混匀。 5.3标准品 16种酚酸类化合物标准品：纯度≥98.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。相关信 息见附录A。 1 NY/T3949—2021 5.4标准溶液的配制 5.4.1标准储备溶液（1mg/mL)：分别准确称取16种酚酸标准品各10mg（精确至0.01mg），用甲醇 （5.1.6)溶解于10mL容量瓶，并定容至刻度，于一18℃下储存于密闭棕色玻璃瓶中，有效期为6个月。 5.4.2标准中间溶液：分别吸取0.2mL标准储备溶液于25mL棕色容量瓶中，用70%甲醇水溶液 （5.2.3）定容至25mL，制成标准中间溶液，现用现配。 5.4.3标准工作溶液：吸取适量标准中间溶液，用70%甲醇水溶液（5.2.3)配制成质量浓度为0.01uμg/mL、 0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/ml、0.5μg/mL、1μg/mL的标准曲线工作溶液，现用现配。 5.5材料 有机相微孔滤膜：孔径为0.22μm。 6仪器设备 6.1高效液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源（ESI-）。 6.2天平：感量0.01mg、0.1mg。 6.3匀浆机。 6.4高速粉碎机。 6.5离心机：转速≥8000r/min。 6.6旋转蒸发仪：带有温度控制。 6.7涡旋振荡器。 6.8涡旋混合器。 7试样制备 试样取可食部进行制备。果汁、酒类等均匀的液体试样直接混匀；带悬浮物的液体试样、新鲜果蔬、半 固体等试样经匀浆机匀浆；固体试样采用高速粉碎机粉碎。试样制备后储存于样品瓶中备用，所有制备试 样于一18℃条件下保存。 8分析步骤 8.1提取 称取试样1g～5g（精确至0.0001g）于50mL离心管中，加入30mL3mol/L氢氧化钠溶液 (5.2.1)，用涡旋振荡器混匀，振荡提取60min，用6mol/L盐酸溶液（5.2.2)调节pH至1.5~2.0，经离 心机8000r/min离心10min，上清液移入分液漏斗，分别用70mL乙酸乙酯（5.1.4)萃取2次，合并乙酸 乙酯萃取液，于35℃～40℃下旋转蒸发至干，加入5mL70%甲醇水溶液（5.2.3），溶解蒸干后的物质，过 滤膜（5.5），待测。 8.2测定 8.2.1仪器参考条件 a) 色谱柱：HSST3色谱柱，柱长100mm，内径2.1mm，颗粒度1.7μum，或性能相当者； 流动相：A为乙睛（5.1.5）,B为水溶液（5.1.1)； c) 进样量：10μL； 柱温：30℃； e) 梯度洗脱程序，见表1； 表1流动相洗脱梯度程序 时间，min 流速，mL/min A,% B,% 0 0. 3 10 90 2 NY/T3949—2021 表1 (续) 时间，min 流速，mL/min A,% B,% 0. 5 0. 3 30 70 1. 0 0. 3 40 60 4. 0 0. 3 60 40 4. 1 0. 3 10 90 5.0 0.3 10 06 扫描方式：离子源为电喷雾电离源负离子扫描方式（ESI-）； g 去溶剂气和锥孔反吹气流速分别 内800L/h和150L/h， ，气体均为高纯氮气； h) 碰撞气流速为0.15mL/n 去溶剂辅助加热温度 400℃ PUBLI ISHIN j) 离子源温度为150 k）监测离子对、碰撞气能量和源内破碎电压见险 8.2.2标准工作曲线 标准工作溶液注 液 相色谱质 8.2.1条件进行测定 物质量 量浓度为横坐标、 响应的峰面积为纵坐标 会制标准 全作曲线！ 8.2.3定性测定 S 在相同试验条件 ，试样 容液中各酚酸美化合物的保留时间与标准工作溶 酸类 化合物的保 留时间的偏差在 5%内1试样溶液中客格酸类化合物的定性离于的相对 浓度 接近的标准 工作溶液中各酚酸类 化合物的定性离子的相对手度进行比较一若偏差不超过表？ 则可判定试 样溶液中存在被测化 种酚酸类化合物的多皮应监测色谱图见附录 表2质谱选择离子丰度允许偏差 CENT 单位为百分号 相对丰度 10 允许偏差 ±50 8.2.4定量测定 试样中各酚酸类化合 作曲线的线性范 围内。 8.3分析结果的表述 试样中酚酸类化合物的含量以质量分数表示， 克按公式 计算。 w= (1) m 式中： w 试样中酚酸类化合物的含量的数值，单位为毫克每千克（mg/kg）； p 从标准曲线上得到的被测组分溶液质量浓度的数值，单位为微克每毫升（μg/mL）； 试样溶液稀释倍数； V. 试样溶液的定容体积的数值，单位为毫升（mL）； m 试样质量的数值，单位为克（g）。 以2次测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。 9精密度 9.1 重复性 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的15%。 3 NY/T3949—2021 9.2 2再现性 在再现性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 10其他 本文件方法丁香酸、香草酸、2,3，4-三羟基苯甲酸和芥子酸的检出限均为0.2mg/kg，定量限均为 0.5mg/kg；龙胆酸、对羟基苯甲酸、3-羟基肉桂酸、2-羟基肉桂酸和咖啡酸的检出限均为0.1mg/kg，定量 限均为0.3mg/kg；原儿茶酸、没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、水杨酸、2,3-二羟基苯甲酸的检出 限均为0.03mg/kg，定量限均为0.1mg/kg。 4 NY/T3949—2021 附录A (资料性） 16种酚酸类化合物标准物质基本信息 16种酚酸类化合物标准物质基本信息见表A.1。 表A.1 16种酚酸类化合物标准物质基本信息 序号 名称 CAS号 英文名称 分子式 相对分子质量 1 阿魏酸 1135-24-6 Ferulic acid Cio Hi. O, 194. 19 2 对羟基苯甲酸 99-96-7 4-Hydroxybenzoic acid C,H,O3 138.13 3 对-香豆酸 501-98-4 P-coumaric acid C,H, O3 164. 16 4 丁香酸 530-57-4 Sringic acid C,HioO. 198. 17 5 龙胆酸 490-79-9 Gentianic acid C, H, O4 154. 12 6 芥子酸