ICS 67.120.10 CCSB45 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3947—2021 畜禽肉中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱 氨酸和硒代蛋氨酸的测定 高效液 相色谱一原子荧光光谱法 Determination of selenocystine, methylselenocysteine and selenotmethionine in livestock and poultry meat by high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry 2021-11-09 发布 2022-05-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3947—2021 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文义件的结构和起草规则》和GB/T 20001.4一2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出。 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口。 所、江西省农业科学院微生物应用所、江西新农园实业有限公司。 本文件主要起草人：魏益华、张金艳、邱素艳、袁林峰、黄青青、张标金、袁丽娟、谢敏、聂根新、戴廷灿、 陈庆隆、董秋洪、陈柳萌、赵云、卢峰。 I NY/T3947—2021 畜禽肉中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的测定 高效液相色谱-原子荧光光谱法 1范围 本文件规定了畜禽肉中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量的高效液相色谱-原子荧光 光谱测定方法。 本文件适用于猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉和鸭肉等备禽肉中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸 的测定。 2 规范性引用文件 RD 下列文件中的内容 通过 可用而构成本 件必 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用 本 期的开用交件袭 所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析 规格租 S 3 3术语和定义 本文件没有 木语和定 4原理 R 试样中硒代胱 码代半胱氨酸和硒代蛋氨酸 深蛋白酶水解提取， 超滤管离心净化， 经反相离子对液相 色谱分 CE 5 试剂和材料 以下所用试剂， 特殊洋 明列 5.1试剂 5.1.1 甲醇(CH:OH 5. 1.2 甲酸（HCOOH 号： 186包 5.1.3 盐酸（HCI,CAS ：7647-01-0 纯度 800 5. 1. 4 磷酸氢二铵[（NH）2HPO,CAS 28 5.1.5 四丁基溴化铵（Ci6H3NBrCAS号：1643-19-2）：离子对色谱 5. 1.6 碘化钾（KI,CAS号：7681-11-0） 5. 1.7 氢氧化钾（KOH,CAS号：1310-58-3）。 5.1.8 硼氢化钾（KBH,，CAS号：13762-51-1)。 5. 1.9 胰蛋白酶（CAS号：9002-07-7）：酶活力≥2500U/mg。 5.1.10蛋白酶（proteaseXIV,CAS号：9036-06-0)：酶活力≥3.5U/mg。 5.2试剂配制 5.2.1甲酸溶液（10%）：量取甲酸5.0mL，用水稀释定容至50mL。 5.2.2流动相（30mmol/L磷酸氢二铵，0.5mmol/L四丁基溴化铵，5%甲醇，pH6.0)：称取磷酸氢二铵 3.96g、四丁基溴化铵0.161g，置于1000mL量筒中，加人水900mL,搅匀，用甲酸溶液（5.2.1)调节溶液pH 至6.0，加人甲醇50ml,用水定容至刻度。经0.45μm尼龙滤膜过滤后，于水浴超声脱气30min，备用。 1 NY/T3947—2021 5.2.3磷酸氢二铵溶液（30mmol/L磷酸氢二铵，pH8.0)：称取磷酸氢二铵3.96g，置于1000ml量筒 中，加人水950mL，用甲酸溶液（5.2.1)调节溶液pH至8.0，用水定容至刻度。 5.2.4硼氢化钾溶液（25g/L)：取水950mL，加人氢氧化钾5.0g，搅匀后加入硼氢化钾25.0g，搅匀后 用水稀释至1000mL。 5.2.5碘化钾溶液（2g/L)：取水950mL，加人氢氧化钾5.0g，搅匀溶解，加入碘化钾2.0g，搅匀溶解后 用水稀释至1000mL。 5.2.6盐酸溶液（10%）：取盐酸100mL,用水稀释至1000mL。 5.2.7盐酸溶液（1%）：取盐酸1.0mL，用水稀释至100mL。 5.3标准品 5.3.1硒代胱氨酸（CHi2N2O,Se2，CAS号：29621-88-3)：L型，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准 物质证书的标准溶液。 质证书的标准溶液。 5.3.3硒代蛋氨酸（C,H.NOzSe，CAS号：1464-42-2)：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书 的标准溶液。 5.4标准溶液配制 5.4.1硒代胱氨酸标准储备液(1000mg/L,以Se计)：准确称取硒代胱氨酸标准品21.6mg，用盐酸溶 液（5.2.7)溶解并定容至10mL。于0℃～4℃冷藏保存，有效期为3个月。 5.4.2甲基硒代半胱氨酸标准储备液（1000mg/L，以Se计）：准确称取甲基硒代半胱氨酸标准品 23.5mg，用水溶解并定容至10mL。于0℃～4℃冷藏保存，有效期为3个月。 5.4.3硒代蛋氨酸标准储备液（1000mg/L,以Se计）：准确称取硒代蛋氨酸标准品25.3mg，用水溶解 并定容至10mL。于0℃～4℃冷藏保存，有效期为3个月。 5.4.4混合标准中间液（10.0mg/L，均以Se计）：准确量取硒代胱氨酸标准储备液（5.4.1)、甲基硒代半 胱氨酸标准储备液（5.4.2)和硒代蛋氨酸标准储备液（5.4.3)各0.50mL于50mL容量瓶中，用磷酸氢二 铵溶液（5.2.3)定容，现用现配。 5.4.5混合标准使用液（0.50mg/L，均以Se计）：准确量取混合标准中间液（5.4.4)5.0mL于100mL 容量瓶中，用磷酸氢二铵溶液（5.2.3)定容，现用现配。 5.4.6混合标准工作液：分别量取混合标准使用液（5.4.5)0.50mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL 和5.0mL于50mL容量瓶中，用磷酸氢二铵溶液（5.2.3）稀释至刻度，摇匀。混合标准工作液浓度为 5μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L和50μg/L的混合标准工作液，现用现配。 5.5材料 5.5.1滤膜：尼龙，0.45μm。 5.5.2超滤离心管：15mL/3ku。 5.5.3一次性过滤器：聚偏氟乙烯，0.45μm。 5.5.4氟气或液氩：纯度≥99.99%。 6仪器设备 6.1高效液相色谱-原子荧光联用仪（HPLC-AFS)：由高效液相色谱仪、在线紫外处理系统和原子荧光光 谱仪组成。 6.2分析天平：感量0.0001g和0.001g。 6.3pH计。 6.4均质器。 2 NY/T3947—2021 6.5涡旋混合仪。 6.6恒温水浴振荡器。 6.7高速离心机（不低于10000r/min）。 7试验步骤 7.1试样制备 选取有代表性样品200g，试样经充分绞碎均勾，装入洁净容器内，密封，标明标记。 7.2试样提取与净化 称取试样约2g（精确至0.001g），置于50mL离心管中，加40mg胰蛋白酶（5.1.9）、40mg蛋白 酶（5.1.10）和8mL磷酸氢二铵溶液（5.2.3），涡旋混匀，于恒温水浴振荡器上55℃、200r/min条件下振 （5.2.3）定容至刻度，再将提取液转移至超滤离心管中，5000r/min离心20min，经0.45um滤膜过滤，待 测。同时做空白试验。 7.3仪器参考条件 7.3.1液相色谱参考条件 7.3.1.1色谱柱：Cl8色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），或相当者。 7.3.1.2流动相：30mmol/L磷酸氢二铵，0.5mmol/L四丁基溴化铵，5%甲醇，pH6.0（5.2.2）。 7.3.1.3流速：0.8mL/min。 7.3.1.4柱温：30℃。 7.3.1.5进样量：100μL。 7.3.2在线紫外处理参考条件 7.3.2.1在线紫外灯：开。 7.3.2.2还原剂：碘化钾溶液（5.2.5）。 7.3.3原子荧光光谱参考条件 7.3.3.1硒灯负高压：310V。 7.3.3.2石 硒灯电流：100mA。 7.3.3.3载气和屏蔽气（均为氩气）流速：350mL/min和750mL/min。 7.3.3.4还原剂：硼氢化钾溶液(5.2.4)。 7.3.3.5载流：盐酸溶液（5.2.6）。 7.4标准曲线 取混合标准工作液（5.4.6），按浓度由低到高依次进样测定，以各种硒形态色谱峰面积和浓度绘制标 准曲线。保留时间定性，外标法峰面积定量。混合标准溶液色谱图见附录A。 7.5试样溶液测定 吸取试样溶液注入高效液相色谱-原子荧光光谱仪中，根据标准溶液的色谱保留时间定性，从标准曲 线得到试样溶液中的各种硒形态浓度。当试样溶液浓度超出标准曲线范围时，应用磷酸氢二铵（5.2.3)进 行适当稀释后测定。 8试验数据处理 试样中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量(均以Se计)按公式(1)计算。 mX1000 (1) 式中： X; 试样中被测组分含量的数值，单位为毫克每千克（mg/kg）； 3 NY/T3947—2021 P: 经标准曲线得到的测定液中被测组分浓度的数值，单位为微克每升（ug/L)； Po 经标准曲线得到的空白溶液中被测组分浓度的数值，单位为微克每升（ug/L)； 定容体积的