ICS 65.020.01 CCS B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3933—2021 水稻品种釉鉴定技术规程 SNP分子标记法 Technical code of practice for xian-geng identification in rice(Oryza sativa L.)SNP marker method 2021-11-09发布 2022-05-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3933—2021 厂食典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部种业管理司提出。 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。 本文件起草单位：中国水稻研究所。 本文件主要起草人：魏兴华、杨窑龙、徐群、章孟臣、王珊、冯跃、袁筱萍、余汉勇、王一平。 NY/T3933—2021 水稻品种釉颗鉴定技术规程 SNP分子标记法 1范围 本文件规定了利用SNP分子标记法对水稻（Oryza sativaL.）品种釉梗鉴定的术语和定义、缩略语、 原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制备、操作步骤、数据记录与统计及判定方法。 本文件适用于水稻品种的梗鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用四构成B件必不可少的条款 其中，注日期的引用文件， 文件。 GB/T3543.2 GB4404.1 食作 物种子 粮 ：禾谷类 GB/T6682 分析 S 3术语和定义 下列术语和定 适用 3. 1 R 釉稻Oryza 水稻的两 分布于低纬度低海拔的热 安亚热带的湿热地 通常 具有分性较强、 1穗节 生殖障 颖壳毛稀而短 CE 3. 2 稻Oryz.a sa 海技地 水稻的两个亚种 布车 韦度的温带以及热带亚热带的高 通常具有分藥性 较弱、颖壳毛密而 发、耐寒性较强的特惠与亚 种间存 定的生殖障碍。 3. 3 单核苷酸多态性 singlehucleotidepolymorphism,sNp 基因组序列之间单个核背酸变异弓起的NA痒列多态性。 3. 4 参照基因组referencegenome 序列分析过程中，以一个已知的样本，序列信息较为清楚的基因组序列为模板对照，该基因组即为参 照基因组，本文件中参照基因组是梗稻品种日本 列（版本号：IRGSP1.0）。 3. 5 型等位变异xian-specificallele 在釉稻品种中分布概率极高并在梗稻品种中分布概率极低的等位变异。 3.6 梗型等位变异geng-specificallele 在梗稻品种中分布概率极高并在釉稻品种中分布概率极低的等位变异。 3.7 釉型指数 xian index 釉型等位变异个数与所有等位变异个数的比值。 NY/T3933—2021 3.8 梗型指数gengindex 型等位变异个数与所有等位变异个数的比值。 3. 9 釉梗特异位点xian-gengspecificlocus 针对品种梗鉴定而提供的，能够将釉稻品种与梗稻品种区分开的位点。 3. 10 参照品种referencesample 代表釉梗特异位点主要等位变异的一组样品。用于辅助确定待测样品在某个位点上的等位变异类 型，校正仪器设备的系统误差。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SNP：单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism） KASP：竞争性等位基因特异性PCR(competitiveallelespecificPCR) FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） HEX：六氯荧光素（hexachlorofluorescein） 5原理 由于水稻稻与梗稻亚种间遗传组成不同，基因组DNA序列存在大量特异单个核苷酸的差异。这 种差异可以通过从供检样品中抽取有代表性的试样进行DNA提取，用釉梗特异性SNP位点引物进行扩 增和分型，从而利用单核苷酸碱基不同而加以区分品种釉梗特性。 6试剂和材料 以下所用试剂，除特殊注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。 6.1氯仿（CHCl3，CAS号：67-66-3)。 6.2异戊醇(C,H2O,CAS号：123-51-3)。 6.3异丙醇（CHO,CAS号：67-63-0)。 6.4无水乙醇（CHCH2OH,CAS号：64-17-5)。 6.5十六烷基三甲基溴化铵[CiH33（CH）：NBr，CAS号：57-09-0]。 6.6乙二胺四乙酸二钠（CloH14N2Na2O:，CAS号：6381-92-6）。 6.7三羟甲基氨基甲烷[NH2C(CH2OH)3，CAS号：77-86-1]。 6.8氯化钠（NaCl,CAS号：7647-14-5）。 6.9氢氧化钠（NaOH,CAS号：1310-73-2）。 6. 10 02XPCRMIX。 6.1170%乙醇：量取350mL无水乙醇（6.4），用水定容至500mL，摇匀，备用。 6. 12 2氢氧化钠溶液（1mol/L)：称取4g氢氧化钠（6.9)溶于水中，用水定容至100mL。 6.13氯仿/异戊醇混合液：氯仿（6.1)和异戊醇（6.2)按体积比24十1混合配置而成。 羟甲基氨基甲烷（6.7）、81.9g氯化钠（6.8）溶解于约900mL水中，用氢氧化钠溶液（6.12）调节pH至 2 NY/T3933—2021 8.0，加水稀释到1L。摇匀，备用。 6.15引物混合液（9.2.1）。 7仪器和设备 7.1离心机：转速≥10000r/min。 7.2分析天平：感量为0.01g。 7.3恒温水浴锅：温度范围室温100℃。 7.4 pH计。 7.5涡旋混合器。 7.6普通PCR仪。 7.7分子荧光扫描仪：荧光定量PCR仪、荧光酶标仪等具有检测FAM和HEX荧光的相关仪器。 8试样制备 供检样品为种子时，其质量应符合GB4404.1中对水稻种子纯度的要求。种子样品的分样，应符合 GB/T3543.2的规定。采用混合样或单株进行检测样品制备，混合样试样来源应至少含有30粒种子或 30个单株的等量新鲜叶片，单株检测应不少于30粒种子样品或30个单株新鲜叶片样品。 9操作步骤 9.1DNA提取 对种子样品进行发芽取样，叶片样品可直接进行DNA提取。取种子发芽后的幼苗或成株叶片约500mg 置于研钵中，加液氮充分研磨，转移约200mg样品至2.0mL离心管。每管加入700μL经65℃预热的 DNA提取液（6.14），充分混合，65℃水浴30min，期间多次颠倒混勾。每管加人500μL的氯仿/异戊醇 混合液（6.13），充分混合后静置10min，10000r/min离心10min。吸取上清液转移至一新离心管，加人 2/3倍体积预冷的异丙醇（6.3），颠倒混勾，10000r/min离心10min，弃上清液，用70%乙醇溶液（6.11） 洗涤2遍，室温自然晾干后，加入100μL水，充分溶解，检测浓度后备用。要求浓度大于20ng/μL，且 DNA样品无降解、无污染。 注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到上述要求的DNA提取方法都适用于本文件。 9.2SNP检测 采用KASP检测技术对样品在釉梗特异SNP位点（见附录A)进行分型。其中，梗稻参照品种为日本 晴，釉稻参照品种为93-11。 9.2.1KASP引物制备 根据附录B中的引物序列信息合成引物，将每个位点的三管引物干粉用水溶解至100μmol/L,2条 上游引物和1条下游通用引物分别取12μL、12μL、30μL混合，再补46μL水；最终2条上游引物、1条下 游通用引物终浓度分别为12μmol/L、12μmol/L、30μmol/L。 9.2.2PCR反应体系 PCR反应可以选择在96孔板、384孔板或1536孔板进行，反应体系的总体积和各组分体积按照表1 进行配制，每板应设空白对照与釉、梗参照品种对照。 9.2.3PCR扩增程序 反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做出适当调整。通常采用下列反 应程序： a) 94℃15min; b）94℃20s，61℃60s，以0.6℃/循环的速度下降，10次循环； 94℃20s55℃60s，26次循环。 若初始反应结束荧光信号弱或分型不理想，可增加d)步骤： 3 NY/T3933—2021 d) 94℃20s57℃60s，3次循环。 表1KASP检测中PCR反应体系 96孔板 384孔板 1536孔板 384孔膜 组分 μL/孔 μL/孔 μL/孔 μL/孔 DNA 1. 5 1.5（烘干） 1.5烘干） 0.8 2XPCRMIX(6.10) 5 1. 5 0. 5 0.8 引物混合液（6.15） 0. 14 0.042 0.014 O"HPP 3.36 1. 5 0.5 总体积 10 3 1 1. 6 9.2.4SNP分型 将PCR扩增产物利用分 荧光扫描仪（7.7）收集不同荧光信号 (FAM492nm；HEX:535nm),根 注：以上为推荐的SN 均可用于本文件。 10 数据记录与统计 对每个SNI 信息进行 据附录A进行釉型 SNP分型结果出现附 录A以外的 SNP 位变异 则将其 SNP 合 型SNP以及缺失的 数目。