ICS 67.180.10 CCS X31 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 1395—2022 GH 蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱含量的测定 液 相色谱-串联质谱法 Determination of matrine and oxymatrine in Honey — Liquid chromatography -tandem mass spectrometry method 2023-02-09发布 2023-03-01实施 中华全国供销合作总社 发布 GH/T 1395 —2022 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华全国供销合作总社提出。 本文件由全国蜂产品标准化工作组（ SAC/SWG2 ）归口。 本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、安徽泓顺源生物科技有限公司 、中国蜂产品协会。 本文件主要起草人：崔宗岩 、刘晓茂、 纪欣欣、 黄学者、贾光群、王治颖、 祖铁红、 汪昌宏、 姜晓 林、谭丽蕊、张进杰、曹彦忠 。 GH/T 1395 —2022 2 蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱含量的测定 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本文件规定了蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱含量测定的液相色谱 -串联质谱法。 本文件适用于蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱含量的测定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样用磷酸 -甲酸铵缓冲溶液溶解提取，经阳离子固相萃取柱净化，液相色谱 -串联质谱仪测定，外 标法定量。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 甲酸（ CH 2O2） ：色谱纯。 5.1.2 甲醇（ CH 3OH） ：色谱纯。 5.1.3 氨水（ NH 3·H2O）。 5.1.4 磷酸（ H3PO 4） ：纯度 ≥85%。 5.1.5 甲酸铵（ NH 4HCO 2） ：纯度 ≥99%。 5.2 溶液配制 5.2.1 磷酸 -甲酸铵缓冲溶液：取 20 mL磷酸（ 5.1.4），6.3 g甲酸铵（ 5.1.5） ，用水稀释至 1 L，混匀。 其中磷酸浓度为 2%（v/v） ，甲酸铵浓度为 0.1 mol/L 。 5.2.2 5%氨水甲醇溶液：取 5 mL氨水（ 5.1.3） ，用甲醇（ 5.1.2）稀释至 100 m L，混匀。 5.2.3 25%甲醇水溶液：取 25 mL甲醇（ 5.1.2） ，用水稀释至 100 mL，混匀。 5.3 标准品 5.3.1 苦参碱（ Matrine，C15H24N2O，CAS号：519-02-8），纯度 ≥98%。 5.3.2 氧化苦参碱（ Oxymatrine ，C15H24N2O2，CAS号：16837 -52-8），纯度 ≥98%。 5.4 标准溶液配制 GH/T 1395 —2022 3 5.4.1 苦参碱和氧化苦参碱标准储备液 （ 1 mg/mL） ： 分别准确称取苦参碱 （ 5.3.1） 或氧化苦参碱 （ 5.3.2） 标准品 10 mg（精确至 0.01 mg） ，置于 10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解、稀释并定容，混匀，配制成浓 度均为 1 mg/mL 的苦参碱和氧化苦参碱标准储备液。 -18 ℃以下避光保存，有效期 6个月。 5.4.2 混合标准中间液（ 10 μg/mL ） ：分别取苦参碱和氧化苦参碱标准储备液（ 5.4.1）各 0.1 mL，于 10 mL容量瓶中，用 25%甲醇水溶液（ 5.2.3）稀释并定容，混匀，配成浓度为 10 μg/mL 混合标准中间液， 2-8 ℃条件下避光保存，有效期 1个月。 5.4.3 混合标准工作液（ 1 μg/mL） ：准确量取混合标准中间液（ 5.4.2）1 mL，于 10 mL容量瓶中，用 25%甲醇水溶液（ 5.2.3）稀释并定容，混匀，配成浓度为 1 μg/mL混合标准工作液， 2-8 ℃条件下避光 保存，现用现配。 5.5 材料 5.5.1 强阳离子固相萃取柱（ MCX）：60 mg/3 mL ，或相当者。 5.5.2 过滤膜：有机系，规格 0.22 µ m。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 6.2 分析天平 ：感量 0.01 g和0.00001 g 。 6.3 涡旋混合器。 6.4 固相萃取装置。 6.5 氮吹仪。 7 试样制备与保存 7.1 试样的制备 对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60 ℃的水浴 中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出 200 g作为试样。制备好的试样置于样品瓶 中，密封，并做上标记 。 7.2 试样的保存 试样于常温下保存。 8 测定步骤 8.1 提取 称取 2 g蜂蜜试样 （精确至 0.01g） 置于 50 mL离心管中， 加入 10 mL磷酸 -甲酸铵缓冲溶液 （ 5.2.1）， 涡旋混匀，待净化。 8.2 净化 强阳离子固相萃取柱（ 5.5.1）依次用甲醇 3 mL和水 3 mL活化，提取液经塞好脱脂棉的漏斗过滤 后过固相萃取柱，依次用 3 mL水和 3 mL甲醇淋洗，抽干，用 5 mL 5% 氨水甲醇溶液（ 5.2.2）洗脱。 收集洗脱液， 45 ℃氮气吹干。加入 25%甲醇水溶液（ 5.2.3）2 mL，涡旋 1 min溶解残余物，微孔滤膜 过滤，液相色谱 -串联质谱仪测定。 8.3 基质匹配标准曲线的配制 精密量取适量混合标准工作液，分别加入 7份经提取和净化的空白试样残渣中， 45 ℃水浴下氮气 吹干，加入 25%甲醇水溶液 2.0 mL，涡旋溶解残余物，配制成浓度为 5 ng/mL、10 ng/mL 、20 ng/mL、GH/T 1395 —2022 4 50 ng/mL 、100 ng/mL 、200 ng/mL 的基质匹配系列混合标准溶液，微孔滤膜过滤，液相色谱串联质谱仪 测定。 8.4 测定 8.4.1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱： T3（2.1 mm × 150 mm, 3 μm ） ，或相当者； b) 流动相：甲醇 +0.1%甲酸水溶液（梯度洗脱，见表 1）； c) 流速： 0.2 mL/min ； d) 柱温： 40 ℃； e) 进样量： 2 µ L。 表1 梯度洗脱条件（ A：甲醇； B：0.1%甲酸水溶液） 时间（ min） 流速（ mL/min） A(%) B(%) 0.0 0.2 1 99 2.0 0.2 1 99 6.0 0.2 90 10 8.0 0.2 90 10 8.5 0.2 1 99 12.5 0.2 1 99 8.4.2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（ MRM）； d) 离子源温度： 120 ℃； e) 脱溶剂温度： 350 ℃； f) 脱溶剂气体流速： 650 L/h； g) 锥孔气流速： 50 L/h； h) 毛细管电压： 3 kV； i) 苦参碱和氧化苦参碱的 MRM参数见表 2。 表2 苦参碱和氧化苦参碱的多反应监测（ MRM）参数 化合物名称 定性离子对 （m/z） 定量离子对 （m/z） 锥孔电压 （V） 碰撞能量 （eV） 苦参碱 249.2/148.1 249.2/176.1 60 30 249.2/176.1 35 氧化苦参碱 265.4/148.1 265.4/205.3 60 30 265.4/205.3 30 265.4/247.4 28 8.5 液相色谱 -串联质谱测定 8.5.1 定性确证 每种被测组分选择一个母离子， 2个以上子离子，在相同实验条件下，试样溶液中苦参碱、氧化苦 参碱的保留时间与基质匹配标准溶液中相应组分的保留时间一致，相对偏差在 ± 2.5%之内，所有离子对GH/T 1395 —2022 5 都出现，且相对离子丰度与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致，其允许偏差应符合表 3 的要求。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ﹥50% ﹥20%~50% ﹥10%~20% ≦10% 允许的相对偏差 ± 20% ± 25% ± 30% ± 50% 8.5.2 定量测定 按照 8.4.1和8.4.2设定仪器条件，以基质匹配标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准 工作曲线，按外标法计算试样中目标物的残留量。基质匹配标准溶液及试样溶液中的目标物响应值均应 在仪器检测的线性范围内。