ICS 67.180.10 CCS X31 GH 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 1394—2022 蜂蜜中寡糖的测定 液相色谱 -质谱/质谱法 Determination of oligosaccharides in honey— liquid chromatography -tandem mass spectrometry method 2023 - 02 -09发布 2023 - 03- 01实施 中华全国供销合作总社 发布 GH/T 1394 —2022 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华全国供销合作总社提出 。 本文件由全国蜂产品标准化工作组（ SAC/SWG2 ）归口。 本文件起草单位： 南京海关动植物与食品检测中心 、中国蜂产品协会 、北京同仁堂蜂产品（江山） 有限公司、 南通海关 综合技术中心 、安徽泓顺源生物科技有限公司 。 本文件主要起草人： 林宏、陆慧媛、 李国伟、徐锦忠、 丁涛、姜珊、陈磊、董勇美、 程晓澳、熊文 慧、汪昌宏、费晓庆、柳菡、张晓燕、王艳、季美泉、王栩璐、 韩燃、王静 。GH/T 1394 —2022 1 蜂蜜中寡糖的测定 液相色谱 -质谱/质谱法 1 范围 本文件规定了蜂蜜中寡糖的液相色谱 -质谱 /质谱测定方法。 本文件适用于蜂蜜中内源和外源性 寡糖的测定和 判定。 本文件所指寡糖为麦芽六糖和麦芽七糖 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 样品经水溶解， 采用液相色谱 -质谱 /质谱法测定，麦芽六糖和麦芽 七糖的标准物质外标法定量 。 4 试剂和材料 4.1 试剂 4.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯 。 4.1.2 甲酸（ HCOOH） ：色谱纯。 4.2 试剂配制 4.2.1 0.1 %甲酸水溶液： 准确吸取甲酸（ 4.1.2）1 mL，置于1000 mL容量瓶中，用 水稀释至刻度，摇 匀备用。 4.2.2 乙腈水溶液 （4+6）：准确量取乙腈 （4.1.1）40 mL 至100 mL容量瓶， 用水稀释至刻度，摇匀 备用。 4.3 标准品 4.3.1 麦芽六糖 标准品（Maltohexaose ，C36H62O31，CAS号： 34620 -77-4）：纯度不低于 98%。 4.3.2 麦芽七糖 标准品（Maltoheptaose ，C42H72O36，CAS号： 34620 -78-5）：纯度不低于 98%。 4.4 标准溶液配制 4.4.1 标准储备溶液： 分别准确称取适量的标准物质 (4.3.1和4.3.2)，用水溶解，配制成1.0 mg/mL 的标 准储备液， 2-8 ℃避光贮存 ，有效期 6个月。 4.4.2 标准工作溶液： 根据需要， 分别移取适量各标准储备液 ， 用乙腈水 溶液 (4.2.2 )稀释成 1.0 μg/mL， 2.5 μ g/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，25 μg/mL，6个标准浓度的工作溶液， 现用现配 。 GH/T 1394 —2022 2 5 仪器和设备 5.1 液相色谱 -质谱 /质谱仪： 串联四极杆质谱 配电喷雾离子源。 5.2 分析天平：感量 0.00001 g和0.01 g。 5.3 涡旋混合器 。 5.4 移液器。 5.5 微孔滤膜： 0.22 μm，有机型。 6 试样制备和保存 对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不 超过 60 ℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水 分挥发。分出 500 g，装入洁净容器，密封，标明标记 。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染。 试样于常温状态下保存。 7 试样处理 准确称取样品 1 g（精确至 0.01 g）置于容量瓶中，用 乙腈水溶液（4.4.2.2）溶解定容至 10.0 mL，取 1 mL溶液经 0.22 μm的滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱 -质谱 /质谱仪测定。 8 测定 8.1 参考液相色谱条件 8.1.1 色谱柱： HILIC ( 100 mm × 4.6 mm ，5 μm)或相当者。 8.1.2 流动相： A，0.1 %甲酸水溶液 ；B，乙腈。 8.1.3 流速：1.00 mL/min。 8.1.4 梯度洗脱程序： 0～0.5 min，15% A； 0.5～3.0 min，15%～40% A；3.0～4.5 min，40% A；4.6～ 6.0 min，15% A。 8.1.5 柱温：室温。 8.1.6 进样量： 10 µL。 8.2 参考质谱条件 8.2.1 离子化方式：电喷雾电离 ESI； 8.2.2 扫描方式： 正离子扫描 ，具体监测离子见附录 A； 8.2.3 检测方式：多反应监测 （SRM）； 8.2.4 离子源温度 ：400 ℃； 8.2.5 喷雾电压 ：2.5 kV； 8.2.6 鞘气：氮气(N2)，流速50 psi； 8.2.7 辅助气：氮气(N2)，流速8 psi。 使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求。 8.3 定性测定 GH/T 1394 —2022 3 在相同实验条件下测定标准溶液和 样品溶液， 若样品溶液中检出色谱峰的保留时间与相应标准溶液 色谱峰的保留时间 一致（允许偏差 ±2.5%），且样品溶液的 质谱离子对相对丰度与浓度相当标准溶液的 质谱离子对相对丰度相比较，相对 离子丰度（ k）的相对偏差不超过表 2规定的范围，则可判定样品中 存在该组分。 表2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 /% k＞50 50≥k＞20 20≥k＞10 k≤10 允许的相对偏差 /% ±20 ±25 ±30 ±50 8.4 定量测定 取标准工作溶液进样，以 麦芽六糖和麦芽七糖 色谱峰面积为纵坐标， 麦芽六糖 和麦芽七糖 的浓度为 横坐标绘制标准工作曲线，外标法定量； 在上述色谱和质谱条件下，化合物的标准物质提取离子（定量）质谱图见附录 B。 8.5 空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。 9 结果计算 样品中麦芽六糖和麦芽七糖 的含量按式 （1）计算： （1） 式中： X — 试样中待测物的含量，单位为 毫克每千克 （mg/kg）； c — 由标准曲线中得出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为 微克每毫升（μg/mL）； V — 样液的定容体积，单位为毫升（ mL）； m — 试样的质量，单位为克（ g）。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留 三位有效数字。 10 方法精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 ％。 11 方法检出限和定量限 麦芽六糖 的检出限 为10 mg/kg，定量限为 50 mg/kg。 麦芽七糖 的检出限 为10 mg/kg，定量限为 50 mg/kg。 12 方法准确度 在50.0 mg/kg、100.0 mg/kg和200.0 mg/kg加标水平进行回收率测定，平均回收率为 80 %-103 %。 mVcXGH/T 1394 —2022 4 13 内源性和外源性寡糖的判定 与结果表述 样品中麦芽七糖 超过定量限，麦芽七糖 子离子689.3/1013.3丰度比大于 1，麦芽七糖 /麦芽六糖含 量比大于 20%，同时满足上述三个条件则 判定样品中含有外源性寡糖 ，结果表述为阳性，否则为阴性。