(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210074017.6 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 中山大学附属第一医院 地址 510080 广东省广州市越秀区中山 二 路58号 (72)发明人 林水宾　郑思仪　马结仪　朱艳　 (74)专利代理 机构 广州专理知识产权代理事务 所(普通合伙) 44493 专利代理师 张凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/48(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/62(2006.01) G06T 5/00(2006.01) G06V 10/44(2022.01) (54)发明名称 一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛 选方法 (57)摘要 本发明公开了一种高效的tRNA甲基化酶抑 制剂筛选方法， 包括步骤构建体外反应筛选体 系， 将待筛选小分子化合物与体外反应筛选体系 混合， 得到反应最终物， 对反应最终物进行Dot   Blot分析， 获得体外反应筛选体系的Dot  Blot扫 描图， 对Dot  Blot扫描图中小分子化合物样本进 行分类， 分析分类后的小分子化合物样本， 获得 缺陷样本， 修复缺陷样本， 进行小分子化合物筛 选。 本发明实现了自动检测缺陷样 本和修复缺陷 样本斑点， 使得后续识别过程更准确。 权利要求书3页 说明书10页 附图1页 CN 114480569 A 2022.05.13 CN 114480569 A 1.一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛 选方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 构建带有His标签的质粒获得重组质粒， 将重组质粒转化进入感受态细胞中； 将带有感 受态细胞的菌液涂布到固体培养基中， 孵育过夜， 加入IPTG， 诱导蛋白表达； 纯化获得的蛋 白； 配制甲基化缓冲液和tRNA ‑Phe GAA储存液， 混合前述纯化后的蛋白、 甲基化缓冲液和 tRNA‑Phe GAA储存液、 甲基供体SAM， RNA酶抑制剂RNasin， 无酶水获得酶反应复合物； 在孔 板的每孔中加入tRNA甲基化酶抑制剂和酶反应复合物， 震 荡斡旋， 混匀离心后在PCR仪中孵 育， 之后加热使酶失活， 之后置 于冰上； 每孔加入10X  SSC溶液， 得到反应最终物。 2.根据权利要求1所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法， 其特征在于， 对每孔 中的反应最终物进行Dot  Blot分析， 扫描Dot  Blot的膜片获得体外反应筛选体系的Dot   Blot扫描图， 每个孔中的反应最终物对应一个tRNA甲基化酶抑制剂或者空白对照， 每个孔 中的反应最终物作为 一个样本， Dot  Blot的膜片可以是纤维素膜或尼龙膜、 NC膜。 3.根据权利要求1所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法， 其特征在于， 所述方 法还包括： 对Dot Blot扫描图中小分子化 合物样本进行分类； 分析分类后的小分子化合物样本， 获得缺陷样本， 修复缺陷样本， 进行小分子化合物筛 选。 4.根据权利要求3所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法， 其特征在于， 对Dot   Blot扫描图中小分子化 合物样本进行分类的子步骤为： 通过边缘检测算子对灰度化的Dot  Blot扫描图进行边缘检测， 边缘检测得到的边缘曲 线将扫描图分为多个封闭区域， 使 所有封闭区域中积大于0.8X的封闭区域构成封闭集合A， X为孔板底部开孔的大小， 获得对照样品的灰度值为GBG； 背景区域指没有加入任何试剂的 膜片区域或者tRNA甲基化酶抑制剂的空白对照孔； 封闭区域集合A＝{GRYi}， i＜N， N为膜上测试点的数量， GRYi为膜上第i个点； 获取封闭 区域集合A中所有封闭区域中孔板对应膜片区域的像素点灰度值的极值， 最大值GMAX与最 小值GMIN与平均值GAVG， GMIN∈[0,255]， GMAX∈[0,255],GAVG∈[0,255]， GMAX＞GAVG， GMIN＜GAVG； 设置第一条件和第二条件： 第一条件： 如果abs(GAVG ‑GMIN)＞abs(GAVG ‑GMAX)则设置第一灰度阈值为GMIN+ (GMAX‑GAVG)， 否则设置第一灰度阈值 为(GMIN+GMAX×GMIN/GAVG)； 封闭区域中所有像素的灰度值的算 术平均值超过第一阈值； 第二条件： 封闭区域的边 缘长度Arc＞log10(CD)×exp(d/2)； 其中， CD为封闭区域的圆正度， CD＝S ×4π/(d/2)2， 式中d为Dot Blot孔板底部开孔的直 径， S为封闭区域的面积， π取3.14， log10()为以10为底的对数函数， exp()为以自然对数为 底的指数函数； 步骤3.1， 初始化空集合第一集合UPA和第二集合DWA， 把封闭区域集合A中符合第一条 件或者第二条件的封闭区域并放入第一集合UPA， 把封闭区域集合A中同时不符合第一条件 和第二条件的封闭区域 放入第二 集合DWA； 步骤3.2， 输出第一 集合UPA和第二 集合DWA。 5.根据权利要求3所述一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛选方法， 其特征在于， 分析分权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114480569 A 2类后的小分子化合物样本， 获得缺陷样本， 修复缺陷样本， 进 行小分子化合物筛选的子步骤 为： 步骤4.1， 遍历第一集合UPA中的封闭区域， 如果封闭区域内像素的灰度值的最大值与 最小值的差值大于2GAVG， 且封闭区域内存在空泡则把当前封闭区域标记为需要执行修复 操作； 其中空泡指试剂没有覆盖的区域或者试剂不足或过量导致反应没有正常发生的区域； 判断是否存在空泡的方法为对选定的封闭区域进 行边缘识别， 根据获得的边缘线得到封闭 区域内的子区域， 如果所有 所述子区域的总面积大于0.1X且子区域的像素的灰度值均小于 G2AVG； 遍历第二集合DWA中的封闭区域， 检测封闭区域的几何中心点到当前封闭区域边缘最 远的距离是否大于sqrt(G2MAX ‑GMIN)×d/2， 如果符合则跳则把当前封闭区域标记为需要 执行修复操作； 其中G2MAX为当前封闭区域中像素的灰度值最大值， G2AVG为当前封闭区域 中像素的灰度值的平均值； 步骤4.2， 对标记为需要执 行修复操作的封闭区域进行修复操作； 步骤4.3， 第一集合UPA和第二集合DWA中灰度值小于抑制剂阈值的封闭区域对应的 tRNA甲基化酶抑制剂为有效， 具体为： 选定一个有效样本， 有效样本可以来自同一个膜上对照的有效tRNA甲基化酶抑制 剂也 可以选自封闭集合A 中的封闭区域， 使有效样本中的像素灰度值的最大值为GCMAX， 使有效 样本中的像素灰度值的中位数为GCMED， 如果一个封闭区域的像素点的灰度值最大值大于 GCMAX且封闭区域的像素点的灰度值的中位数大于GCMED+GMIN， 则标记此封闭区域的对应 反应最终物中的tRNA甲基化酶抑制剂无效， 如果此封闭区域在步骤4.2中被标记为无效子 区域则判定此封闭区域的tRNA甲基化 酶抑制剂的Dot  Blot测试无效； 如果膜片上有反应最 终物的位置但不包括在封闭区域集合A中的封闭区域， 即步骤3中没有被边缘检测到的区域 或者此反应最终物的位置不包含在封闭区域集合A中的任意封闭区域， 则膜片上有反应最 终物的位置对应的tRNA甲基化酶抑制剂有效。 6.根据权利要求5所述 一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛 选方法， 其特 征在于， 步骤4.2中对封闭区域进行修复操作的子步骤为： 步骤4.2.1， 对封闭区域进行边缘识别， 根据获得的边缘线得到封闭区域内的封闭子区 域， 一个子区域的几何中心点到所在封闭区域的几何中心点的欧氏距离dx， 封闭区域的几 何中心点到一个子区域边缘的最大值SMAX和最小值SMIN， 取得最大值的点Pmax和最小值的 点Pmin； 步骤4.2.2， 如果SMAX＞sqrt(dx ×Pmin)×exp(SMAX/SMIN)且d(Pmax,Pmin)＞MEAN (dx)则把封闭子区域从当前封闭区域剔除， 剔除封闭子区域指把封闭子区域从当前封闭区 域中移除， 不参与后续步骤的统计； d(Pmax,Pmin)为获得点Pmax和点Pmin的直线距离， sqrt ()为取平方根操作， exp()为以自然对数为底的指数函数， MEAN(dx)为取所有封闭子区域 的几何中心点到 封闭区域的几何中心点的距离的平均值； 步骤4.2.3， 重复步骤4.2.2直到 封闭区域内的封闭子区域被遍历完成。 7.一种高效的tRNA甲基化酶抑制剂筛 选系统， 其特 征在于， 所述系统包括： 图像截取模块： 用于获取Dot  Blot扫描图；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114480569 A 3